原花青素的生物活性

背景及概述^[1]

原花青素是一类由儿茶素、表儿茶素或没食子酸聚合而成的多酚类黄酮化合物。广泛存在于水果、蔬菜、花朵、坚果和树皮中。在植物体内可转变为花青素。流行病学资料表明花青素有降低肠胃癌症风险、心血管病风险及预防女性尿路感染等作用。原花青素又名缩合鞣质，在自然界分布广泛，且常存在于日常食品和许多植物中，如红酒、松树皮等。很多食源性的原花青素可以在日常生活中被人们所摄取，并且具有很强的生物活性，如花生种皮中的原花青素可以降血糖，苹果中的原花青素具有抗癌活性，红酒中的原花青素可预防心血管疾病等。这些研究结果揭示原花青素可作为食源性药物用于疾病治疗。目前，原花青素已被应用于药品、保健品和食品等领域。美国近年批准的仅有的两个天然药物均为原花青素类，分别是绿茶的儿茶素组分（商品名Veregen）和秘鲁巴豆中纯化出的原花青素低聚体Fulyzaq（商品名Crofelemer），国内外也开发出许多原花青素保健品，如康恩贝生产的葡萄籽芦荟软胶囊等；在食品领域，原花青素可作为天然的食源性防腐剂，原花青素的生物活性强、自然来源丰富、可通过饮食摄取，对人体健康和疾病防治有重要作用。

结构^[2]

原花青素是以黄烷-3-醇为结构单元通过C—C键聚合而形成的化合物，其结构取决于五方面：1）黄烷-3-醇单元的类型；2）单元之间的连接方式；3）聚合程度（组成单元的数量）；4）空间构型；5）羟基是否被取代（如羟基的酯化、甲基化等）。根据原花青素的聚合程度可分为单倍体（monomer）、寡聚体（oligomer）和多聚体（polymer），其中单倍体是基本结构单元，寡聚体由2～10个单倍体聚合而成，多聚体则由10个以上的单倍体聚合而成。

1. 单倍体

单倍体是构成原花青素的结构单元，属于黄烷-3-醇类化合物，该类成分可通过一定方式连接形成原花青素。单倍体一般是儿茶素（catechin）和表儿茶素（epiactechin），但是也有其他的单倍体，如多一个羟基的表没食子儿茶素（epigallocatechin）或少一个羟基的表阿夫儿茶精（epiafzelechin）。上述4种单倍体的化学结构如图所示。

2. 寡聚体

寡聚体是指由2～10个单倍体通过一定方式连接起来的化合物，该类成分是原花青素研究中最活跃的部分，不断有新的化合物被报道。寡聚体的分类标准有聚合度、连接方式和单倍体类型：聚合度是指组成原花色素的结构单元个数，是区分原花青素的重要标准之一。随着原花青素聚合程度的增加，分子质量也成倍地增加，羟基越多，和填料之间的吸附越大，分离越困难，在图谱解析中，各个结构单元的峰重叠在一起，结构鉴定难度随着聚合度增加而加大，因此随着聚合度的增加（四聚体以上），被报道的原花青素单体从数量上减少。寡聚体的连接方式有两种，一种为单倍体通过C2—O—C7的醚键和C4—C8或C4—C6两个键连接在一起，称之为A型（A-typeprocyanidins）；另一种为单倍体通过C4—C8或C4—C6一个键连接在一起，称之为B型（B-typeprocyanidins），在自然界中，多数植物含有的是B型原花青素，只有少数植物，如花生、荔枝和肉桂等富含A型二聚体。大多数寡聚体的结构单元是儿茶素或表儿茶素，但是也有少数寡聚体是由表没食子儿茶素或表阿夫儿茶精组成的。本文将寡聚体按照聚合度分类，对每种聚合度包含的不同连接方式和单倍体进行一一介绍。

1）二聚体

二聚体是由两个单倍体通过一定的方式连接起来的化合物，根据其连接方式分为两种，分别是通过C—C键和C—O—C连接的A型，如原花青素A1和通过一个C—C键连接的B型，如原花青素B。结构单元种类也很多，如结构单元含有表阿夫儿茶精的表阿夫儿茶精-表儿茶素（epiafzelechin-(4β→8)-epicatechin）、含有表没食子儿茶素的表没食子儿茶素-(2β→O-7，4β→8)-表儿茶素。

2）三聚体

三聚体是通过一定方式连接的3个单倍体组成的化合物。多数三聚体，如原花青素C1（procyanidinC1）通过两个C—C单键连接。也有三聚体如肉桂鞣质B1（cinnamtanninB1混合有两个C—C单键和一个C—O—C醚键连接的单元。还有非常少见的三聚体具有两组C—C单键和醚键的连接方式，如七叶树鞣质C。还有比较特殊的三聚体，其结构单元并非全部是儿茶素或表儿茶素，而是其他单倍体构成，如表儿茶素-(2β→O-7，4β→8)-表阿夫儿茶精-(4α→8)-表儿茶素。

3）四聚体

四聚体是4个单倍体通过一定连接方式组成的化合物。连接方式有很多种，如只是通过C—C单键连接的化合物如肉桂鞣质A2（cinnamtanninA2），或者除了C—C单键还有1个C—O—C醚键的连接如表儿茶素-(2β→O→7，4β→8)-表儿茶素-(4β→8)-儿茶素-(4α→8)-表儿茶素（epicatechin-(2β→O→7，4β→8)-epicatechin-(4β→8)-catechin-(4α→8)-epicatechin），或者结构中有两个C—O—C醚键形成的四聚体，如长节珠鞣质A2（parameritanninA2）。结构单元组成也有多种，如从蕨类植物中分离得到的骨碎补素（davallin）四聚体的构成单元含有表阿夫儿茶精。

4）五聚体

5个单倍体通过一定连接方式形成的化合物是五聚体，目前分离得到的单体较少，种类也较少。已分离得到的五聚体大多的是通过C—C单键连接，如肉桂鞣质A3（cinnamtanninA3）。目前仅有一个化合物是含有C—O—C醚键的五聚体：表儿茶素-(4β→8)-表儿茶素-(4β→8)-表儿茶素-(2β→O→7，4β→8)-表儿茶素-(4α→8)-儿茶素。五聚体结构单元具有多样性如表阿夫儿茶精-(4β-8)-[表没食子儿茶素-(4β-8)-]3-儿茶素中同时具有表没食子儿茶素和表阿夫儿茶精。

5）六聚体

六聚体是指6个单倍体通过一定方式连接在一起形成的化合物，也是目前从天然产物中分离得到的聚合度最高的原花青素单体。随着聚合度的增大，分离难度加大，被报道的六聚体的种类和数量都较少，其结构单元种类也较少，仅有儿茶素或表儿茶素。如结构中只有C—C单键的肉桂鞣质A4（cinnamtanninA4），或结构中有1个C—O—C醚键的菲律宾楠B（machiphilitanninsB）。

3. 多聚体

多聚体是指聚合度大于10的原花青素，由于分子结构庞大，一般是以混合物的形式存在，该类化合物很难分离得到单体，其化学结构通常以图7中的形式表示。多聚体通常以分子质量区间来定义，其鉴定也和单体原花青素不同，通常是检测其构成单元的类型和种类，以及连接方式的类型。

生物活性^[2]

1. 抗氧化活性

原花青素具有极强的抗氧化活性，是一种良好的自由基清除剂和脂质过氧化抑制剂，其作用机制是原花青素结构中有多个酚性羟基在体内释放H＋，竞争性地与自由基结合，从而保护脂质不被氧化，阻断自由基链式反应，并且反应后产生的半醌自由基能通过亲核加成反应生成具有儿茶酸及焦酚结构的聚合物，仍然具有很强的抗氧化活性，实验证实原花青素及其代谢产物的自由基清除活性一般强于VC和VE。原花青素的构效关系显示其抗氧化活性与聚合度、羟基的数量及位置、连接方式和空间构型有关，活性强度一般随着聚合度的增加而增加，但是有的四聚体活性低于三聚体；C3位置的甲氧基化和糖基化会降低活性；对于B型二聚体，C4—C8连接方式的活性要大于C4—C6连接方式；表儿茶素的活性大于其同分异构体儿茶素。同时，抗氧化活性强度受溶剂影响，在水相中增强，在油相中降低。原花青素可使人血清丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量下降4.80%，超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）活力升高2.31%，谷胱甘肽过氧化物酶（glutathioneperoxidase，GSH-Px）活力升高2.45%，并且能显著降低CCl4中毒小鼠肝脂质过氧化损伤，表明原花青素具有较强的抗氧化活性。

2. 防治心血管疾病

著名的法国悖论指出红葡萄酒有益健康，能预防心血管疾病，其中发挥作用的主要成分就是原花青素。原花青素可以清除自由基、降低胆固醇水平、减少血小板黏附、保护血管内皮细胞，从而降低血液的黏度、改善微循环、减轻氧化应激损伤，达到预防心血管疾病的目的。

1)抗心肌缺血再灌注损伤

心肌缺血再灌注损伤是在血液循环障碍造成缺血后，又恢复供血时出现微血管和实质器官的损伤，主要是由氧自由基引起的。原花青素强大的自由基清除作用可以减少心肌缺血再灌注损伤。原花青素能明显降低血浆中MDA含量、天冬氨酸氨基转移酶（aspartateaminotransferase，AST）和乳酸脱氢酶（LDH）的活性，提高SOD活性，减少心肌梗死面积。葡萄籽原花青素有助于心脏功能的恢复，也有利于降低心肌缺血再灌注性心律失常的发生率，且能显著增加Na＋/K＋-ATPaseα1亚基的表达。同时，ShaoZouhui等[33]发现通过激活蛋白激酶Akt和内皮型一氧化氮合酶（endothelialnitricoxidesynthase，eNOS），可以提高一氧化氮（nitricoxide，NO）浓度，减少再灌注后的细胞死亡和恢复收缩功能，从而起到保护心血管的作用。

2)抗动脉粥样硬化

动脉粥样硬化是由于动脉内膜胆固醇、类脂肪等黄色粥样物质积聚而导致的病变。原花青素通过清除自由基、调整脂蛋白代谢紊乱，起到抗动脉粥样硬化的作用。通过建立动脉粥样硬化兔子模型，口服给予葡萄籽原花青素后，兔血清低密度脂蛋白（lowdensitylipoprotein，LDL）氧化产物明显减少，表明葡萄籽原花青素通过降低兔子血浆和动脉壁组织液的自由基，从而抑制LDL氧化，表现出抗动脉粥样硬化的作用。MDA在动脉粥样硬化的形成过程中有极重要的作用，通过修饰LDL成为MDA-LDL后，能被单核巨噬细胞辨识、内饮，形成泡沫细胞，造成动脉粥样硬化，采用61名健康人做为研究对象，在12周内分别给予葡萄籽原花青素药片和安慰剂，采用单盲法测定MDA-LDL水平，结果表明从第6周开始，服用原花青素药片比服用安慰剂的受试者血浆中MDA-LDL明显降低，证实葡萄籽原花青素能有效降低LDL氧化，防治动脉粥样硬化。建立新西兰大白兔动脉粥样硬化模型，用1%葡萄籽原花青素颗粒饲料喂食，测定兔血清中各项指标。病理学结果发现兔血清C反应蛋白水平在第1周末期明显下降，作用可持续至实验结束，并且动脉粥样硬化病变程度（主动脉壁厚度和泡沫细胞数量）明显降低，由此认为原花青素抗动脉粥样硬化的作用机制与降低血清C反应蛋白水平有关。

3）保护血管内皮细胞

内皮细胞结构和功能的改变是多种心血管疾病的共同病理基础，其中NO是内皮细胞最重要的舒血管因子，能抑制血小板聚集，抑制单核细胞黏附于内皮细胞。原花青素可通过增加NO的合成，保护血管内皮细胞，进而保护心血管系统。采用两肾一夹法建立肾血管性高血压大鼠模型，采用葡萄籽原花青素治疗6周后发现大鼠尾动脉收缩压显著降低，其作用机制与增强抗氧化活性，增加NO的产生和释放，降低血管内皮细胞中内皮素的蛋白表达有关。证实葡萄籽原花青素能够防止过氧亚硝基攻击血管内皮细胞，改善冠状动脉内皮细胞，增加NO的合成，增强人体动脉内皮依赖性舒张反应，从而达到保护心血管系统的目的。

3. 降血压

高血压是一种以动脉血压持续升高为特征的进行性“心血管综合征”，常伴有其他临床病症，需要患者长期服药，因此需要寻找有效的、低毒性、适合长期使用的药物治疗高血压。以高血压患者和健康人共计119名作为研究对象，进行4个月饮食干预，高剂量组（每餐给予300mg原花青素）中93%的血压恢复正常，由此认为葡萄籽原花青素可以作为非药物干预方法治疗高血压。建立家兔离体胸主动脉环灌流模型，发现葡萄籽原花青素能减少Ca2+内流、促进NO的释放、舒张主动脉血管、降低血压，同时葡萄籽原花青素也能降低正常家兔的动脉血压。其他植物中的原花青素也具有抗高血压作用，如博森草莓种子原花青素能明显降低自发性高血压大鼠的收缩压。

4. 降血脂

原花青素能够降低血液胆固醇、甘油三酯水平，从而起到降血脂作用。如给高胆固醇饮食大鼠喂食苹果，30d后，大鼠血清总胆固醇、甘油三酯和LDL的含量分别降低21.0%、27.2%和20.4%，苹果中所含的原花青素类成分（儿茶素、表儿茶素和原花青素B1）是其降脂主要成分。还有葡萄籽、可可、花生种皮等食材中所含有的原花青素均有降脂作用，表明可以考虑将食源性原花青素作为非药物方法治疗高血脂。

5. 降血糖

原花青素的降血糖作用机制如下：1）减少肠道的糖吸收，如花生种皮原花青素能抑制小肠二糖酶活性，从而减少小肠中麦芽糖和蔗糖的吸收，其中3个三聚体（肉桂鞣质D-1、表儿茶素-(2β→O→7，4β→8)-[儿茶素-(6→4β)]-表儿茶素、表儿茶素-(4β→8)-表儿茶素-(2β→O→7，4β→8)-儿茶素）的降血糖活性强于二聚体和儿茶素，并且活性和结构单元有关，如以表儿茶素为单元的低聚物活性大于以儿茶素为单元组成的低聚物；2）作用于胰岛β细胞，促进胰岛素释放，如葡萄籽原花青素作用于胰岛β细胞，影响胰岛素的合成、分泌和基因表达，修复受损线粒体超极化，减少三磷酸腺苷合成和改变细胞的膜电位，并且减缓葡萄糖转运蛋白2抗体葡糖激酶和解偶联蛋白基因表达以及改变肝脏降解酶的表达，从而影响胰岛素降解。不同连接方式的原花青素可能具有不同的降血糖机制，如在肉桂中A型和B型原花青素均有降血糖作用，但作用机制不同，A型原花青素能提高血液和胰腺中的胰岛素浓度，而B型原花青素提高脂肪组织和肝脏的脂质积累。

6. 抗肿瘤

原花青素的抗肿瘤作用机制是通过抗氧化、抗炎、调节信号分子（如Bcl-2、c-Fos、c-Jun、Ki67等）的表达、促进肿瘤细胞凋亡、阻滞细胞周期及抑制血管生成等作用达到抗肿瘤目的。从月见草脱脂种子中提取的原花青素，用于人乳腺癌细胞株（MDA-MB-231）培养72h后，癌细胞存活率降低50%，侵染力降低65%，原花青素通过调节血管内皮生长因子（VEGF）和转录因子c-Fos、c-Jun的表达水平，加速乳腺癌细胞凋亡、抑制乳腺癌细胞的侵染力。采用H22细胞建立小鼠肝癌异种移植模型，连续10d采用不同浓度葡萄原花青素作用后测定VEGF和肿瘤微血管密度，发现两者存在正相关，且都随着原花青素浓度增加而降低。

7. 其他活性

原花青素还被报道具有其他活性，如抗菌、抗病毒、抗炎，治疗干眼症、白内障等作用。密罗木中的原花青素被报道具有较强的抗单纯疱疹病毒活性，可直接与病毒包膜相互作用，卫矛科植物中的原花青素被报道具有较强的抗艾滋病病毒活性。发现葡萄籽原花青素通过激活过氧化酶活化增生受体γ抗体和抑制晚期糖基化终末产物受体的表达，抑制炎症因子表达，并保护内皮细胞。原花青素在眼部疾病治疗中有良好的作用，如缓解干眼症、抑制白内障发生，还可用于治疗视网膜疾病、角膜疾病等。

吸收代谢^[2]

原花青素的吸收代谢已受到越来越多的重视，此方面研究有利于促进原花青素的开发应用。对原花青素的吸收代谢主要集中在体外的Caco-2细胞模型研究和体内代谢研究。

1. Caco-2细胞模型

Caco-2细胞模型作为研究表皮细胞药物转运和代谢的体外模型已被广泛应用于口服药物的筛选和研究药物肠吸收过程中，也常用于原花青素的吸收代谢研究。如采用该方法研究可可中原花青素吸收，发现糖蛋白阻碍原花青素的吸收，并检测到原花青素B2产生少量的代谢产物表儿茶素、3’-O-表儿茶素和4’-O-表儿茶素。使用Caco-2细胞模型测定可可中3种原花青素（儿茶素、表儿茶素和原花青素B2），认为它们通过细胞旁路转运。利用该方法探讨山楂中不同聚合度原花青素的肠道吸收机制，发现山楂原花青素混合物之间没有促进渗透作用或协同效应。使用人类肠道上皮分化Caco-2细胞模型结合液相色谱-质谱联用技术，检测蔓越莓中A型原花青素，发现在蔓越莓所含的A型原花青素二聚体、三聚体和四聚体均可以被人体吸收。

毒理学研究^[2]

原花青素是一类广泛分布于自然界的物质，具有很强的生物活性，现代毒理学研究表明该类成分安全性良好。采用犬和小鼠为观察对象，给予葡萄籽提取物，动物行为、进食量等均未见异常，血液学指标、血液生化指标和尿液指标、病理组织学检查未见异常改变，心血管系统、中枢神经系统和呼吸系统无明显不良影响。急性毒性和长期毒性实验证实葡萄籽原花青素可以安全应用。

制备^[1]

一种从葡萄籽中高效低耗提取原花青素的工艺方法，具体包括以下提取分离过程：

一、使用榨汁机对新鲜的葡萄籽进行榨汁，并使用超临界二氧化碳萃取法除去榨汁得到的葡萄籽渣料中的油脂，使用200目的纱布进行过滤，以收集富含原花青素的葡萄籽渣料；超临界二氧化碳萃取过程：静态夹带剂为50％的乙醇，超临界萃取温度为35℃，超临界萃取压力为26MPa，超临界萃取时间为20min；

二、以65％的乙醇作为提取液，对所述富含原花青素的葡萄籽渣料进行超声波提取，并使用300目的纱布进行过滤，以收集富含原花青素的提取液；超声波提取过程为：超声波功率为280W，超声波提取次数为三次，次超声波提取的超声波时间为8.5min，第二次超声波提取的超声波时间为5.5min，第三次超声波提取的超声波时间为3.5min；

三、对所述富含原花青素的提取液进行纯化：使用SP825大孔吸附树脂对所述富含原花青素的提取液进行吸附一段时间，吸附时间为1.1小时；使用pH值为1.5的酸水溶液对吸附有富含原花青素的提取液的大孔吸附树脂进行洗涤至洗涤液澄清，再使用纯化水对所述大孔吸附树脂进行冲洗；依次使用15％乙醇、20％乙醇、25％乙醇及30％乙醇对SP825大孔吸附树脂进行洗脱，并将收集的不同梯度的洗脱液进行混合；对混合后的不同梯度的洗脱液进行减压浓缩，从而得到原花青素浸膏。

四、使用微波干燥法对所述原花青素浸膏进行干燥，得到原花青素粉末。

该实施从葡萄籽中提取得到的原花青素的提取纯度为99.8％，提取率为92％。

主要参考资料

[1] 营养科学词典

[2] 原花青素的研究进展

[3] CN201710980658.7一种从葡萄籽中高效低耗提取原花青素的工艺方法