食品中志贺氏菌的检验方法详解

志贺氏菌是引起人类急性感染性痢疾最为常见的食源性病原菌，俗称痢疾杆菌，为革兰氏阴性无芽孢杆菌，无动力，无荚膜，无鞭毛、有菌毛，在营养培养基上生长良好。根据其抗原构造的不同，可分为A、B、C、D四个亚群，分别是痢疾志贺氏菌、福氏志贺氏菌、鲍氏志贺氏菌和宋氏志贺氏菌。

志贺氏菌具有高度传染性，易引起的细菌性痢疾，主要通过消化道途径传播，这与卫生条件差，食物和水污染以及拥挤的生活条件有关。据调查，全球每年约有1.6亿人患病，大约有110万人死亡，其中绝大多数是儿童。在中国最为常见的是由福氏和宋内志贺菌引起的菌痢，在内陆地区分布广泛，是各地卫生部门重点检测的对象。

目前，针对志贺氏菌的特点和危害，国家卫生部已将志贺氏菌列入了肉、蛋、水产、饮料、调味品、糖果及酒类等食品的检验标准中，并制定了与之相对应的检测方法标准——《食品安全国家标准食品微生物学检验志贺氏菌检验》(GB4789.5-2012)。今天，我们就共同来了解下食品中志贺氏菌的检验标准吧。

1.适用对象

适用于食品中志贺氏菌的检验。

2.主要仪器

分液器

拍击式均质器

定量接种环

厌氧培养系统

生化鉴定系统

3.主要培养基

志贺氏菌增菌肉汤

麦康凯（MAC）琼脂

木糖赖氨酸脱氧胆酸盐（XLD）琼脂

三糖铁（TSI）琼脂

半固体琼脂

营养琼脂 

4.检测流程及方法

4.1样品制备

固体/半固体样品：用天平无菌称取25g样品，加入装有225mL志贺菌增菌肉汤的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1~2min，制成1:10的稀释样液。

液体样品：用无菌移液管或移液器吸取25mL样品，加入盛有225mL志贺菌增菌肉汤的无菌锥形瓶或均质袋中，混匀后制成1:10的稀释样液。

4.2增菌

将制备好的样品溶液置于厌氧体系（厌氧体系可由自动厌氧培养系统或厌氧产气袋等方式实现）中，在41.5±1℃条件下培养16～20h。

4.3分离

用无菌的定量接种环沾取增菌后的志贺氏增菌液，分别在XLD琼脂平板和MAC琼脂平板上划线接种，置于36±1℃培养箱中培养20～24h后，观察各个平板上生长的菌落形态，菌落特征如表所示：

4.4初步生化试验

1）分别在MAC琼脂平板和XLD琼脂平板上选取2个以上典型或可疑菌落；2）先用接种环挑取同一菌落，分别接种到TSI琼脂斜面、半固体琼脂和营养琼脂斜面，再用接种针在TSI琼脂斜面和半固体琼脂斜面上进行穿刺；3）标记清楚后置于36±1℃培养箱内，培养20～24h，观察结果。

观察TSI琼脂中斜面产碱、底层产酸、不产气、不产硫化氢，且半固体琼脂中无动力的菌株，挑取对应的营养琼脂斜面上生长的菌苔，进行生化试验和血清学分型。

4.5生化试验

用营养琼脂斜面上生长的菌苔，进行生化试验，包括β-半乳糖苷酶、尿素、赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶以及水杨苷和七叶苷的分解试验。由于福氏志贺氏菌6型的生化特性和痢疾志贺氏菌或鲍氏志贺氏菌相似，必要时还需加做靛基质、甘露醇、棉子糖、甘油试验，也可做革兰氏染色检查和氧化酶试验，应为氧化酶阴性的革兰氏阴性杆菌。生化特性见表2。

由于传统生化试验过程需要使用大量试剂，且还需保证有足够量的菌苔，因此有时可能需再次对可疑菌落进行扩繁。针对这些问题，目前常采用生化试剂盒或生化鉴定系统来完成这一步骤，以减少操作人员的工作量、降低工作难度，缩短检测周期。

全自动微生物生化鉴定系统

4.6血清学鉴定（选做项目）

凡疑为志贺氏菌，可挑取营养琼脂斜面上的培养物，做玻片凝集试验。

1）抗原准备：志贺氏菌属抗原结构由菌体抗原（O）及表面抗原（K）组成。一般采用1.2%～1.5%琼脂培养物作为玻片凝集试验用的抗原。

2）清凝集反：在玻片上选取2块约1cmx2cm的区域，用接种环挑取一环待测菌分别放入选定区域内，往其中一块下部加1滴抗血清，另一区域下部加1滴生理盐水（对照），分别将菌落研成乳状液，将玻片倾斜摇动，使菌与抗体/生理盐水混合，1min后并对着黑色背景观察结果。

抗血清中出现凝结成块的顆粒，且生理盐水中没有发生自凝现象，那么凝集反应为阳性。

5.结果报告

综合以上生化试验和血清学鉴定的结果，报告25g（mL）样品中检出或未检出志贺氏菌。