血液琼脂基础的应用

背景^[1-3]

血液琼脂基础又叫做血平板、血平皿，是一种富含动物血液成分的琼脂平板，常用于微生物学实验中检测不同细菌对血液成分的反应；血琼脂平板通常由琼脂、肉汤、羊血或牛血等成分组成，其中的蛋白胨和牛肉粉主要提供细菌生长所需要的碳源、氮源、氨基酸及维生素；氯化钠维持培养基中的渗透压，琼脂用做凝固剂。脱纤维羊血一方面提供一些特殊的生长因子，另一方面用于观察溶血反应。血琼脂平板可以用于分离和鉴定许多不同类型的微生物，如溶血性链球菌、李斯特氏菌、弧菌、金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌等。

血液琼脂基础

血液琼脂基础检验原理：

胰蛋白胨、大豆蛋白胨提供碳氮源、维生素和生长因子；氯化钠维持均衡的渗透压；脱纤维羊血提供丰富的营养物质；琼脂是培养基的凝固剂。

溶血现象有关不同细菌在血琼脂平板上的溶血情况：

（1）肺炎链球菌的α溶血和乙型溶血性链球菌的β溶血，α溶血又称草绿色溶血，菌落周围会形成草绿色的溶血环，β溶血又称完全溶血，菌落周围会形成透明的溶血环。

（2）各种李斯特氏菌的溶血及协同溶血情况。伊氏李斯特氏菌、斯氏李斯特氏菌和单增李斯特氏菌呈现完全溶血现象，英诺克李斯特氏菌无溶血现象；伊氏李斯特氏菌靠近马红球菌溶血增强，单增李斯特氏菌靠近马红球菌和金黄色葡萄球菌落血均增强。

（3）我妻氏培养基上弧菌的溶血情况：副溶血性弧菌（ATCC33847）菌落周围有透明的β溶血环，溶藻弧菌菌落周围无溶血环。

（4）金黄色葡萄球菌的溶血情况：金黄色葡萄球菌（ATCC6538）菌落周围呈现完全溶血。

血琼脂基础的选择在实际工作中，可根据要求选择不同的血琼脂基础，如营养琼脂、豆粉琼脂或哥伦比亚琼脂（用于营养要求较高的细菌的培养及溶血试验）等，加蒸馏水溶解后高压灭菌。冷却至50℃～55℃，加入一定量的血液，缓慢混匀后倾注平板。通常来说，如果只是想看一下溶血情况，只要用最基本的营养性琼脂，加入脱纤维羊血制成平板使用即可。但《GB4789食品安全国家标准 食品微生物学检验》系列标准中，针对不同细菌检验时，所规定的血琼脂的基础配方又有所不同。

使用说明

称取本品33.0g于1L蒸馏水或去离子水中（可按比例增加或减少配制量），加热煮沸至完全溶解,分装,121℃高压灭菌15分钟或115℃灭菌30分钟，灭菌结束后请摇匀，以防琼脂沉积于器皿底部而凝固，冷至50-55℃，无菌操作沿瓶壁缓缓加入5-7%于35℃保温过的无菌脱纤维绵羊血，轻轻摇匀，倾注平板，凝固，备用。

应用^[4][5]

血液琼脂基础可以用于刚果嗜皮菌选择性分离方法的研究及盘羊分离株的分离鉴定

以分离纯化并鉴定的刚果嗜皮菌绵羊株和发病盘羊病变皮肤为试验材料,采用平板涂抹的方法,研究病料样品的不同的预处理方法、血液琼脂基础、增菌活化剂、杂菌抑制剂对刚果嗜皮菌的分离效果的影响,以期建立一种用于实验室分离纯化刚果嗜皮菌的高效简便的方法,并在此基础上,对发病盘羊皮肤病料进行刚果嗜皮菌的分离,并对刚果嗜皮菌盘羊分离株进行菌落与形态学鉴定、家兔人感染试验、PCR鉴定及RAPD分析。

血液琼脂基础结果如下：1、皮肤病料在无菌蒸馏水室温静置浸泡15天后,取上清接种于pH7.0 6%酵母膏活化液中,60℃培养30min,再涂于绵羊血液琼脂平板,37℃培养48h,可获得较多的刚果嗜皮菌典型菌落。菌落经染色镜检,可观察到呈不规则状及少量的圆形孢子。而采用将病料悬液经37℃水浴1h、烛罐处理15min均未分离到目地菌；0.05%SDS及0.05%SDS 6%蛋白胨的活化液对病料中的刚果嗜皮菌无活化作用。6%酵母膏的最佳活化温度为60℃30min；刚果嗜皮菌在高氏Ⅰ号培养基上生长不良,在普通营养琼脂培养上不生长,在LB琼脂培养基上的生长情况不如绵羊血液琼脂基础；常用于放线菌分离培养中防止杂菌生长的孔雀石绿和重铬酸钾抑菌剂,在本试验中无明显抑制杂菌生长的作用,不适合作为刚果嗜皮菌分离培养的选择性抑菌剂。本试验所建立的刚果嗜皮菌分离纯化方法可为动物与人类嗜皮菌病的病原学研究提供有用的技术手段。2、采用本研究建立的刚果嗜皮菌分离方法,从发病盘羊皮肤病料中分离获得刚果嗜皮菌(盘羊株),经培养特性、菌体染色与形态特性、PCR检测、分离株间接免疫酶染色鉴定,以及家兔感染试验均与绵羊分离株相同。说明来自同一地区发病的刚果嗜皮菌绵羊和盘羊分离株的某些生物学特性基本一致。3、对刚果嗜皮菌绵羊株和盘羊株的DNA进行随机引物扩增多态性DNA(RAPD)分析,扩增产物有一定的多态性,根据欧氏遗传距离公式计算出遗传距离为0.6667,显示盘羊株与绵羊株的基因组DNA有不同程度的差异。

参考文献

[1]A simple and efficient method for releasing DNA from Dermatophilus congolensis[J].A.A.Makinde;;C.L.Gyles.Journal of Microbiological Methods,1998(3)

[2]Experimental chronic dermatophilosis[J].D.Davis;;M.Philpott.Proceedings of the Royal Society of Edinburgh.Se,1980(1-3)

[3]Microbial technologies for the discovery of novel bioactive metabolites[J].Stefano Donadio;;Paolo Monciardini;;Rosa Alduina;;Paola Mazza;;Claudia Chiocchini;;Linda Cavaletti;;Margherita Sosio;;Anna Maria Puglia.Journal of Biotechnology,2002(3)

[4]Rare genera of actinomycetes as potential producers of new antibiotics[J].Ameriga Lazzarini;Linda Cavaletti;Giorgio Toppo;Flavia Marinelli.Antonie van Leeuwenhoek,2000(3)

[5]丁国婵.刚果嗜皮菌选择性分离方法的研究及盘羊分离株的分离鉴定[D].石河子大学,2011.