端粒酶的应用实例

背景^[1-3]

端粒酶（Telomerase），在细胞中负责端粒的延长的一种酶，是基本的核蛋白逆转录酶，可将端粒DNA加至真核细胞染色体末端，把DNA复制损失的端粒填补起来，使端粒修复延长，可以让端粒不会因细胞分裂而有所损耗，使得细胞分裂的次数增加。端粒在不同物种细胞中对于保持染色体稳定性和细胞活性有重要作用，端粒酶能延长缩短端粒（缩短的端粒其细胞复制能力受限），从而增强体外细胞的增殖能力。端粒酶在正常人体组织中的活性被抑制，在肿瘤中被重新激活，从而可能参与恶性转化。端粒酶在保持端粒稳定、基因组完整、细胞长期的活性和潜在的继续增殖能力等方面有重要作用。端粒酶的存在，就是把DNA复制的缺陷填补起来，即把端粒修复延长，可以让端粒不会因细胞分裂而有所损耗，使得细胞分裂的次数增加。

端粒（Telomere）是存在于真核细胞线状染色体末端的一小段DNA-蛋白质复合体，它与端粒结合蛋白一起构成了特殊的“帽子”结构，作用是保持染色体的完整性和控制细胞分裂周期。

端粒酶

人类TERC（也被称为人类端粒酶RNA的TR或hTR）基因于1995年被克隆，并且在所有正常人类细胞中普遍表达。编码端粒酶催化亚基的人类TERT（也称为hTERT）基因于1997年被克隆。TERT在大多数正常人细胞中未检测到，但在几乎所有癌症细胞中都有表达，并迅速被认为是晚期人类癌症的一个几乎通用的标记物。由于很难获得足够大的肿瘤样本用于Greider和Blackburn的经典引物延伸端粒酶活性测定，因此病理学家急切地采用了一种基于PCR的测定，即端粒重复扩增方案（TRAP），来检测档案库中感兴趣的肿瘤类型。

由于大多数正常组织中没有端粒酶活性，而且几乎所有人类肿瘤（85-90%）不仅组成性表达端粒酶，而且端粒也较短，因此抑制端粒酶成为并仍然是癌症治疗的一个诱人靶点。然而，到目前为止，还没有任何抗端粒酶疗法被批准用于任何适应症。这当然不是因为缺乏尝试，但很可能是由于从抑制端粒酶到端粒短到足以导致细胞进入危机并发生凋亡的漫长滞后期。此外，由于正常细胞如造血增殖细胞瞬时表达端粒酶活性，限速毒性作用降低了直接端粒酶抑制剂的效用。此外，在一些较罕见的癌症类型中，基于ALT的维持机制可能涉及DNA重组14，因此人们担心有效的端粒酶抑制剂可能参与这种基于ALT生存途径。

应用^[4][5]

端粒酶可以用于基于氧化型TMB和双发射荧光比率探针灵敏检测端粒酶

建立了三种简便检测端粒酶的新方法。一方面,基于3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）氧化前后产生的颜色变化,以及产生相应的光热效应,建立了一种比色和光热同时检测端粒酶活性的新方法;另一方面,基于比率型荧光探针,建立了两种荧光检测端粒酶活性的新方法。

具体研究内容如下:第一,基于氧化型TMB比色和光热双模式灵敏检测端粒酶。G-四联体（G-quadruplex）是由富G的DNA序列折叠形成的。氯化血红素（Hemin）能够嵌入G-四联体中,形成一种具有催化活性的DNA模拟酶（DNA酶,DNAzyme）。本文利用端粒酶延伸产物重复序列（TTAGGG）富含G碱基,能够形成G-四联体的特点,加入血红素形成DNAzyme。这种DNA酶能够有效催化TMB和H2O2溶液发生氧化反应,生成氧化TMB（ox TMB）,颜色由无色变为蓝色,实现比色检测。随着端粒酶延伸产物的增多,样品溶液蓝色逐渐加深;同时,溶液在650 nm处的吸光度逐渐增强。我们可以根据吸光度的变化,更加准确的对端粒酶进行定量检测。而且,ox TMB可以作为光热探针,通过激光诱导光热效应,将光转化为热,通过检测温度的变化可以实现对端粒酶的定量检测。

第二,基于双发射荧光比率探针结合端粒酶延伸产物自放大效应检测端粒酶。在这部分研究中,我们利用功能化的磁性微球（表面标记链霉亲和素STV的磁球）的富集和分离作用来提高方法的选择性和检测的准确性。首先通过STV与生物素（biotin）的特异性作用,将端粒酶延伸产物富集于磁球表面。然后加入一端标记有葡萄糖氧化酶（GOD）,碱基序列与端粒酶延伸产物两个重复序列互补的DNA探针（MP-GOD）进行杂交反应。GOD就会连接到磁球表面上。由于端粒酶延伸产物包含有多个重复序列,能够捕捉多个MP-GOD探针,形成自放大效应。端粒酶的含量越多,那么富集在磁球表面的GOD就越多。被磁球捕捉的GOD与加入的葡萄糖反应,生成相对应量的双氧水（H2O2）。生成的H2O2猝灭双发射荧光探针外层绿色量子点,显示出内层红色荧光染料的荧光,以此实现端粒酶的可视化荧光检测。

第三,基于双发射荧光比率探针结合杂交链式反应（HCR）信号放大灵敏检测端粒酶。首先,通过STV与生物素（biotin）的特异性作用,将端粒酶延伸产物富集于磁球表面。然后,一个DNA探针与端粒酶延伸产物重复序列杂交,并引发标记有GOD的另外两个DNA探针在磁球表面形成交替杂交,形成杂交链式反应信号放大。大量的GOD就会连接到磁球表面上,通过GOD与葡萄糖反应生成H2O2,H2O2猝灭双发射荧光探针外层绿色量子点的荧光,显示出内层红色荧光染料的荧光,以此实现端粒酶的可视化荧光检测。

参考文献

[1]CuS quantum dots activated DNAzyme for ratiometric electrochemical detection of telomerase activity[J].Sun Yujie;Dong Qi;Yang Huan;Song Weiling;Zhou Hong.Analytica Chimica Acta.2023

[2]Sensitive and amplification-free detection of telomerase activity by self-extension of telomerase and trans-cleavage of CRISPR/Cas12a[J].Wang Honghong;Wang Shuhui;Wang Hui;Liang Yuanwen;Li Zhengping.Talanta.2023

[3]Label-free palindromic DNA nanospheres as naked-eye colorimetric assay platform for detection of telomerase activity[J].He Jing-Lin;Tang Ling;Liao Shi-Qing;Guo Mei-Tong;Wu Ling;Song Yinghui;Liu Sulai;Cao Zhong.Talanta.2023

[4]A ratiometric fluorescent biosensor based on magnetic-assisted hybridization chain reaction and DNA-templated silver nanoclusters for sensitive microRNA detection[J].Wong Zheng Wei;Muthoosamy Kasturi;Mohamed Nur Aliana Hidayah;New Siu Yee.Biosensors and Bioelectronics:X.2022

[5]毕晓涵.基于氧化型TMB和双发射荧光比率探针灵敏检测端粒酶[D].河北大学,2023.