志贺氏菌

背景及概述^[1][2]

志贺氏菌(Shigella)是目前致肠道感染的主要病原菌之一，属于肠杆菌科的志贺氏菌(Shigella)属，又称痢疾杆菌，为革兰氏阴性杆菌，需氧或兼性厌氧。人类对痢疾杆菌有很高的易感性，幼儿可引起急性中毒，死亡率甚高。临床上通常表现腹部痉挛痛、腹泻和发热，患者将不能从事饮食业、炊事及保育等工作。志贺氏菌在不卫生和人口密集的条件下可迅速传播，如餐厅、食堂。据统计，每年全球感染志贺氏菌的人数高达2 亿，其中95％的致死病例发生在发展中国家。尽管我国尚未建立完善的食源性致病菌报告和检测机制，每年仅记录的志贺氏菌感染病例就高达40万，仅次于肝炎和结核。

制备^[1]

 一种志贺氏菌培养方法，包括如下步骤：

将硝酸纤维素膜用志贺氏菌抗血清处理一次以上，晾干后再用质量百分数为1％～1.5％的硫代硫酸钠处理，晾干，得到含志贺氏菌抗血清和硫代硫酸钠的硝酸纤维素膜；将所述含志贺氏菌抗血清和硫代硫酸钠的硝酸纤维素膜加入至 含志贺氏菌的悬浮液中，于36.8～37.2℃条件下放置30～35分钟，得到含志贺氏菌的硝酸纤维素膜；将所述含志贺氏菌的硝酸纤维素膜用磷酸缓冲液洗涤；将所述用磷酸盐缓冲液洗涤后的硝酸纤维素膜涂板于培养基，在 36.8～37.2℃条件下培养18～24小时。本发明志贺氏菌培养方法，通过使用含志贺氏菌抗血清和硫代硫 酸钠的硝酸纤维素膜，根据抗原抗体反应的特异性，硝酸纤维素膜中 志贺氏菌抗血清与样本中的志贺氏菌特异结合，硫代硫酸钠能防止其 他的细菌在膜条上的生长，通过洗涤将其他细菌洗脱，将吸附有较纯浓度志贺氏菌的硝酸纤维素膜条接种于培养基并进行培养，减少了其他细菌，特别是侵袭性大肠菌落对志贺氏菌菌落的影响，保证样本中低浓度志贺氏菌不出现漏检，从而提高志贺菌的检出率。图1是本发明志贺氏菌培养方法得到的SS琼脂平板菌落图

检测^[2-3]

一、检测试剂盒

CN201710552746提供一种用于志贺氏菌的检测试剂盒、检测方法及应用。

采用了如下的技术方案：一种用于志贺氏菌的检测试剂盒，所述检测试剂盒用于实时荧光RPA检测志贺氏菌，以志贺氏菌侵袭性质粒抗原H基因作为靶基因，根据其保守序列设计有一对引物和一条探针，其中，所述的一对引物和一条探针的序列如下所示：

上游引物：5'-CTGCATGGCTGGAAAAACTCAGTGCCTCTG-3'

下游引物：5'-GTTCTGACTTTATCCCGGGCAATGTCCTCC-3'

探针：5'-CCATCAGGCATCTGAAGGCCTTTTCGA-FAM-dT-THF-A-BHQ1 -dT- GATACCGGCGCTCTGCTC-C3-3'。

本发明还提供一种用于志贺氏菌的检测方法，所述检测方法为实时荧光RPA方法，所述检测方法至少包括以下步骤：步骤1、从待测样品中提取基因组DNA；步骤2、采用上述用于志贺氏菌的检测试剂盒对步骤1所提取的所述DNA进行等温 扩增反应；其中，所述等温扩增反应的温度为37-39℃，时间为20-30min；步骤3、通过判断反应结果是否为阳性，确定待测样品中是否存在志贺氏菌。本研究以志贺氏菌侵袭性质粒抗原H基因(ipaH)作为靶基因，根据其保守序列设 计特异性引物及exo探针，建立了用于食品中志贺氏菌快速检测的real-time RPA方法。

相对于现有技术，本发明提供的用于志贺氏菌检测的实时荧光RPA方法的建立，具有以下优势：

(1)操作简便，仅需增菌提取核酸后即可上机检测，所有试剂均以冻干粉的形 式保存在反应管中；

(2)反应时间短，不需要热变性，20min内即可完成；

(3)反应结果可直接 观察，无需电泳检测；

(4)便携式荧光检测设备的使用。

本方法中使用的Genie III等温扩增荧光检测系统紧凑小巧，轻便耐用，仅为1.75kg左右，触摸屏操作，无需连接电脑，其内置长航时锂电池，可在无电源环境中全天户外工作，可用于微生物性食品中毒事件原因的现场检测。进一步地，本发明还提供所述的检测试剂盒或检测方法在志贺氏菌检测技术领域的应用。本研究中运用建立的real-time RPA方法，对人工污染志贺氏菌的不同样品进行检测，当样品污染量为46CFU/25g、增菌6h时，鸡肉中可检出志贺氏菌。

二、快速检测

一种快速检测志贺氏菌的方法，包括以下步骤：

1)纳米微球的制备：

a.添加0.4-0.8mmolFeCl₃·6H₂O和0.2-1.6mmol FeCl₂·4H₂O到100mL的去离子水中，向溶液中通入氮气并加热到80-120℃，然后将3-7mL 25％的NH₃·H₂O添加到混合液中， 反应2h；用永磁铁从反应溶液中分离出黑色的固体物质用高纯水清洗3～5次，得Fe₃O₄纳米粒子；

b.取12mg Fe₃O₄纳米粒子用1-10mL去离子水和20mL乙醇的混合液重悬，先在缓慢 搅拌的条件下加入0.3-0.9mL的NH₄OH溶液，再将10-300uL正硅酸乙酯溶解在50uL乙醇溶液 中逐滴加入，室温下反应12h，在Fe₃O₄纳米粒子表面形成一层二氧化硅，用去离子水溶液清洗几次，在乙醇溶液中复溶得到二氧化硅包覆的Fe₃O₄纳米粒子；

c.把10-300uL的正硅酸乙酯，20mL无水乙醇，1-10mL去离子水和1mL 0.5-3mg/L的 啡啰啉联钌(Ru(bqy)₃²⁺)混合，将混合溶液加入0.5mL二氧化硅包覆的Fe₃O₄纳米粒子，最后 加入600-900μL的NH₄OH，剧烈搅拌3h，得到Fe₃O₄/ Ru(bqy)₃²⁺纳米微球，用去离子水清洗备 用；

d.将1mL的巯丙基三甲氧基硅烷添加到10mL的乙醇溶液中，用该混合物复溶Fe₃O₄/ Ru(bqy)₃²⁺纳米微球，在常温下300rpm搅拌12h后，再80℃300rpm搅拌1h，离心得到硅烷化的 Fe₃O₄/ Ru(bqy)₃²⁺纳米微球；

e.将硅烷化的Fe₃O₄/ Ru(bqy)₃²⁺纳米微球添加到包含0.06g NaHCO₃，0.08g十二烷 基苯磺酸钠，0.05mL苯乙烯，0.15mL丙烯酸和0.5g过硫酸钾溶液的50mL的水溶液，水浴70 ℃，200r/min下搅拌，反应5h后得羧基化的Fe₃O₄/ Ru(bqy)₃²⁺纳米微球；

2)取0.5-2mg羧基化的Fe₃O₄/ Ru(bqy)₃²⁺纳米微球加入1mL偶联缓冲液中，调节pH至 5-10，加入0.05-0.18mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐

(EDC)活化羧基，及100-400μg抗志贺氏菌单抗，在温度37℃时，放在10-15rpm的旋转仪上偶联60-120min，磁分离3-5min，弃上清；用清洗缓冲液冲洗3-5遍之后，取1mL封闭剂与纳米微球混合封闭0.5-1h，得到Fe₃O₄/ Ru(bqy)₃²⁺纳米微球-单抗；

所述偶联缓冲液配制方法如下：将3mL 19.07g/mL的硼砂与7mL 12.37g/mL的硼酸 混合后，稀释10倍体积；

所述清洗缓冲液配制方法如下：称取0.43g 2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)溶于200mL 的无菌蒸馏水中，调pH为5.5-6.0；

所述封闭剂配制方法如下：取100mg牛血清白蛋白(BSA)加入1mL磷酸盐(PBS)缓冲 液配成封闭剂；

3)培养志贺氏菌，将菌液调整浓度为106CFU/mL、105CFU/mL、104CFU/mL、103CFU/ mL，各取1mL备用；取待测样品溶液1mL、各浓度菌液1mL，分别与100-150μg Fe₃O₄/ Ru(bqy)₃²⁺纳米微球-单抗，于温度37℃，旋转仪转速10-15rpm混合孵育30-60min，孵育后磁分离3- 5min后，弃上清，用PBS缓冲液清洗后，复溶于PBS中得Fe₃O₄/ Ru(bqy)₃²⁺纳米微球-单抗-菌；

4)免疫层析试纸条的制备：将样本垫用pH 8.50.1M Tris-HCl缓冲液(1％BSA， 0.5％Tween-20)浸泡处理，置于60℃鼓风干燥箱，2h后取出备用；将志贺氏菌兔多抗和驴抗鼠二抗喷到硝酸纤维膜上分别作为检测线(T线)和质控线(C线)，浓度均为1-2mg/mL，喷量 均为0.75uL/cm，37℃真空干燥过夜取出置于干燥缸中备用；将过滤垫、样本垫、硝酸纤维 膜、吸水纸依次粘贴在PVC底板上，贴好后将其切成4mm宽的试纸条，装卡；将制备好的试纸 条装入铝箔袋中，加干燥剂密封，置于干燥缸中保存备用；

5)试纸条对样品的检测：将收集到的Fe₃O₄/ Ru(bqy)₃²⁺纳米微球-单抗-菌稀释到 50-150μg/mL，取100μL滴加到试纸条加样孔中，10-15min后，用荧光读取仪记录T线、C线荧光强度和T/C的值；

6)定性分析：用肉眼观察结果进行定性分析，T线显色则说明样品中有志贺氏菌，T线不显色则说明样品中没有志贺氏菌或是含有志贺氏菌的量低于103CFU/mL；

7)定量分析：使用荧光读取仪测量T线、C线的荧光强度，以及T/C值，以不同菌的浓度为横坐标，T/C值为纵坐标绘制标准曲线，确定普通样品中的志贺氏菌数量。

主要参考资料

[1] CN201210068111.7 志贺氏菌的培养方法

[2] CN201710552746.7 用于志贺氏菌的检测试剂盒、检测方法及应用

[3] CN201610032168.X 一种快速检测志贺氏菌的方法