胆红素的检测方法

胆红素是血红蛋白及其类似物的代谢产物，在血液中包括以白蛋白为载体的脂溶性游离胆红素（Bu,多数）和经肝脏极性转化后的水溶性结合胆红素（Bc,少量）。临床实验室常用的胆红素检测方法为重氮法，根据能否与重氮试剂直接反应，将胆红素从方法学上分为“直接反应胆红素”和“间接反应胆红素”，即：直胆和间胆。其中间胆需要有加速剂（如咖啡因、苯甲酸钠等）使胆红素氢键破坏后与重氮试剂反应。

那么在此基础上，问题的关键就在以下两点：

1、直接胆红素的问题

直胆理论上是指所有能溶于水的胆红素，而实际上只包括了参与快反应（60秒）的大部分Bc,却又因反映环境中的某些因素（如乙醇、尿素、咖啡因、尿酸等）可破坏氢键，少量游离胆红素也会参与直接反应。这也是为什么健康人的直胆理论为0而实际测得不为0的原因。简言之：实际测得的直胆=大部分Bc+少许Bu。

2、δ-胆红素的问题

在高胆红素血症时，患者血液中的白蛋白长时间“浸泡”在胆红素环境中，发生酶促反应，白蛋白置换部分葡萄糖醛酸和胆红素以共价键牢固结合，成为δ-胆红素（Bδ）。也就是说，Bc=mBc(单糖)+dBc(双糖)+Bδ。在实质性黄疸或阻塞性黄疸急性期Bδ可达20%-50%；而当临床恢复期总胆红素开始下降时（Bc半衰期仅几小时），由于Bδ的半衰期长（与白蛋白相同，约21天），其比例可上升至50%-90%。

由于Bδ可溶于水，当然参加了直接胆红素反应。在结合胆红素得到正确治疗发生快速下降时，而Bδ不易消除，就可能出现“直胆比例越治越高”的假象，与临床预期“不相符”的检测结果。

检测方法

目前已有其他检测方法可以避免以上现象，如HPLC和胆红素的干片法检测。其中干片法在临床应用较为广泛，它的胆红素结果不再是湿化学法提供的总胆红素、直接胆红素和间接胆红素，而是总胆红素、结合胆红素、游离胆红素以及δ胆红素。而且干化学法可以减少黄疸、脂浊对于胆红素的影响，对于一些高胆红素标本来讲，湿化学法往往会出现检测值高于实际值的正向干扰情况，而干化学可以很好的规避黄疸对胆红素的检测干扰。

1、胆红素检测的常用方法及其优缺点

（1）湿化学法：反应均在液体试剂中进行，重氮法、氧化酶法、化学氧化（如钒酸盐氧化法）法等。

A、重氮法：在强酸（pH1-2）条件下，胆红素和重氮离子偶联，形成有颜色的偶氮化合物，重氮胆红素显色的强度与胆红素浓度呈比例，光电比色测定。优点：可直接比色，手续简单、易于自动化。缺点：重氮试剂不稳定，须由亚硝酸钠和氨基苯磺酸临时生成；易受溶血、脂血等因素干扰，胆红素浓度过高时影响准确度。

B、氧化酶法：胆红素氧化酶催化样品中的胆红素氧化，生成胆绿素引起450nm处吸光值下降。优点：灵敏度高，特异性好。缺点：试剂较昂贵，并受酶的稳定性、纯度等的影响，易受脂血、溶血的影响。

C、化学氧化法：胆红素的四吡咯结构具有还原性，因此各种低分子的武技氧化剂和在一定条件下具有氧化性的各种镀金属元素都可以氧化胆红素。常见种类有钒酸盐氧化法、硝酸盐钠氧化法、高碘酸氧化法。优点：不受溶血、脂血等干扰物质的影响，准确度高，特异性好，与酶法相比具有试剂价格低廉，精密度更高的优点。

D、钒酸法：在pH=3的条件下，血清胆红素可经钒酸氧化成胆绿素，从而使胆红素特有的黄色减少，可根据加入钒酸前后450nm处吸光度的下降与血清胆红素呈正比。该法也是临床常用的生化检测方法之一，简单、快速、稳定，线性范围宽，能抵抗溶血、血脂干扰。

(2) 干化学法：反应在干试剂片上进行，无液体试剂

将液体检测样品直接加到为不同项目特定生产的商业化的干燥试剂条上，以被测样品的水分作为溶剂引起特定的化学反应，利用反射光度法或差示电极法测量，是以酶法为基础的一类分析方法，又有干试剂化学或固相化学之称。主要具备以下特点：操作简单、准确度高、速度快、抗干扰作用强、灵敏度高，目前常用于生化急诊标本的检测，还可用于对常规检测结果进行方法学评价等。

(3)其他：

高效液相色谱法（HPLC）、分光光度法、荧光探针法、单克隆抗体法、传感器法。方法学的差异使得不同检测方法的可比性差。