Carbohydrate Polymers | 羧甲基壳聚糖的聚集行为

给大家介绍一篇今年发表在Carbohydrate Polymers上的文章。在这篇文章中，作者进行分子动力学模拟研究 CMCS（羧甲基壳聚糖） 在水中的聚集行为，以及脱乙酰度(DD) 、取代度 (DS) 和电离状态（不同的 pH 条件）的影响。CMCS在中性条件下更容易聚集，分子链交错堆叠自组装成多聚体，而在酸性和碱性条件下分别通过扭曲堆叠和平行堆叠形成二聚体或三聚体。随着DD和DS的增加，在中性和碱性条件下聚集变弱，而在酸性环境中聚集变强。分子内氢键的存在在酸性、碱性和中性条件下分别导致单个链的扭曲、共面和延伸构象，从而导致它们独特的链间堆叠结构。随后，特定的分子间氢键、疏水和静电相互作用稳定了聚集结构。

CMCS链通常由β- (1→4)-连接的D-氨基葡萄糖主链和C6-OH位置上的取代羧甲基侧链以及C2-NH2位置上残留的乙酰氨基组成(图1a）。这项工作中CMCS的主链构象由糖苷键的两个二面角（φ和ψ）表示，指的是每个键处围绕两个醚键的旋转（图1b）。为了阐明DD和 DS 在构象动力学和聚集行为中的作用，作者设计了含有不同DD和DS组合的CMCS 分子（图 1c)。所有的CMCS都包含五个片段，乙酰氨基和羧甲基基团分布均匀。

为了了解两性结构的质子化状态如何影响 CMCS 分子的聚集，作者研究了三种 pH 条件下 CMCS 的三种质子化状态（完全带正电荷、带负电荷和双电荷）。根据实验结果，羧基的 pKa 值在2.0和4.0之间，氨基的大约在6.5至6.8之间。在这项工作中模拟了强酸性（pH ~ 1-2）和强碱性（pH~10-14）环境，以分别说明CMCS完全带正电和带负电状态的影响。此外，氨基在中性条件下（pH ~ 7）被部分质子化，用于研究CMCS的双电荷状态。

图1

聚集动力学

作者研究比较了 DD、DS 和电离状态对聚集行为的影响。团簇数和相应的团簇大小分布（每个簇的 CMCS 分子数）如图2所示。在中性条件下，所有的CMCS都可以聚集成团簇簇，簇数最小（图3a）；相应地，更多的 CMCS 分子被整合到一个团簇中（图3b）。在这种情况下，电离的 CMCS 具有较低的电荷（见图 1c 中的净电荷），导致分子间能量势垒减少，同时质子化氨基（-NH3+）和去质子化羧基（-COO-）之间形成额外的静电吸引力，可以促进聚集。同时，作为离子化氢键供体或受体的双电荷结构（-NH3+和-COO-）与非离子化对应物形成的氢键相比，有利于形成更强的电荷辅助氢键。额外的静电吸引力和氢键相互作用的结合是中性条件下形成强而稳定的聚集的原因。另一方面，在酸性和碱性条件下，单电荷CMCS结构导致更强的静电排斥，而胶体大分子之间的氢键相互作用更弱。弱的吸引能量不能将更多的CMCS链合并到簇中，也无法克服静电排斥的能量障碍来稳定聚集体，导致聚集受限和波动。

图2 

此外，DD和DS在聚集过程中也起着至关重要的作用。对于中性和碱性条件下的低羧甲基化系统（CM1CS1、CM1CS2 和 CM1CS3），它们的团簇数略有增加，并且团簇大小随着DD的增加而降低，即聚集能力减弱。对于具有相同 DD 的系统（CM1CS2、CM2CS2、CM3CS2 和 CM4CS2），随着 DS 的增加，聚集进一步显着减少。相比之下，DD和DS在酸性条件下对CMCS的聚集表现出相反的作用，即随着DD和DS的增加，聚集趋势变得更加明显。团簇大小相应增加，显示出更少的单聚体，而出现更多的二聚体。与在中性和碱性条件下增加–COO- 基团阻止 CMCS 聚集不同，酸性形式的羧基 (-COOH) 促进了聚集，因为链之间的静电排斥减弱以及 -COOH 基团之间形成分子间氢键的可能性增加。

聚集机理

除了静电作用，作者对各种CMCS系统进行了关于氢键的进一步机理分析。图3a描绘了CMCS分子之间形成的氢键的总数。由于双电荷结构，在中性pH值下形成更多的氢键，然后是碱性和酸性条件下。在三种pH条件下形成的氢键数量与各自酸碱环境中的聚集能力一致，证实了氢键相互作用是聚集的主要吸引力。然而，酸性条件下的氢键总数随着DD和DS的增加而增加，而在中性和碱性条件下则略有下降趋势。因此，酸性条件下增强的聚集可归因于增强的氢键相互作用。此外，作者比较了由羧基的主要基团（-COO -/COOH)、乙酰氨基 (-NHC=O) 和主链上的醚氧原子 (O-main)形成氢键的情况，结果如图3b所示。-COO -/COOH基团的氢键从特定氢键供体接受，如图3c所示，对于中性和碱性条件，氢键主要在–COO-和–OH 之间形成。在酸性条件下，形成的氢键表现出对DS的依赖性。对于低羧甲基化体系（CM1CS1、CM1CS2 和 CM1CS3），–COOH 和 –NH3+之间形成的氢键数量增加随着 DD 的增加，对总氢键的增加有显着贡献。虽然从-NHC=O基团接受的-COOH的氢键数量随着DD的增加而减少（完全脱乙酰化的CM1CS3减少到0），但由于-NHC=O的数量较少，它并没有显着改变趋势团体。另一方面，对于高羧甲基化体系（CM2CS2、CM3CS2 和 CM4CS2），–COOH 基团更倾向于与其自身形成氢键，导致由–COOH 形成的氢键数量减少；然而，总氢键数量的增加被 -NHC=O 和醚氧原子中氢键数量的增加所补偿。值得注意的是，侧链上的-COOH基团之间的氢键主要是分子间的，因为它们在链外交替分布，这支持了在酸性条件下随着DS的增加而促进聚集的结果。

图3

聚集结构

CM2CS2分子可以在三种pH条件下自组装成三种不同的结构，如图4a所示。在酸性、中性和碱性条件下，作者将它们分别分类为扭曲堆叠、交错堆叠和平行堆叠。其他 CMCS 在各自的 pH 条件下显示相同的堆积模型，CMCS在不同pH条件下的带电状态对其聚集结构有很大影响，而DD和DS的变化主要影响它们的聚集团簇大小。对于中性条件下的交错聚集结构，在团簇内形成了密集的氢键网络。此外，在聚集结构的中间可以观察到头对尾的连接。其中最小和电位分布在分子链的两端，两性聚合物之间的静电相互作用有助于它们通过交错堆叠聚集（图4 c）。根据在中性溶液中的实验测量中观察到的微凝胶形态，这种交错堆叠可以演变成网状凝胶状结构。

    对于酸性条件下的扭曲堆积，观察到-COOH之间的分子间氢键可以稳定聚集结构。这种扭曲的堆叠可以演变成球形纳米结构，类似于酸性条件下的壳聚糖聚集体（Philippova et al., 2012）。然而，对于碱性条件下的平行堆叠，-COO-之间的大部分H 键和-OH基团是分子内的，不能稳定堆叠结构。在酸性和碱性条件下形成的分子内或分子间氢键的直接观察证实了氢键分析。因此，碱性条件下单电荷CMCS之间缺乏分子间氢键和静电排斥表明它们的聚集体应该有其他稳定作用。通常，聚集过程由聚合物-聚合物和聚合物-水相互作用决定。为了评估这种竞争，作者在簇中每个分子链的 3 Å 范围内呈现溶剂化层和平均溶剂可及表面积 (SASA)。如图6 b所示，水分子通常被排除在核心之外，即形成疏水域。考虑到 CMCS 的化学结构，疏水性吡喃糖环主要负责疏水性相互作用。这种效果在碱性条件下很明显，其中吡喃糖环平行堆叠形成疏水核，而亲水侧链浸入溶剂中。因此，可以得出结论，吡喃糖环的疏水相互作用在这种聚集过程中起重要作用，这在其他多糖中也观察到（Uto et al., 2020）。这种以平行方式排列的链倾向于演变成纳米纤维. 此外，由分子间氢键形成的聚集体的连接区也可以被检测为疏水域并从溶剂中筛选出来 ( Philippova et al., 2012 )，这解释了在中性和酸性条件下排除水的原因。因此，CMCS在不同电离状态下的链间相互作用伴随着SASA的降低。正如预期的那样，可以发现 SASA 和团簇数之间的良好相关性，如图 6 d 所示。具体来说，SASA 值越低，聚集程度越强。同时，CMCS 的相互作用扩大了 SASA 差异，也表明聚集行为取决于 CMCS 的结构参数（DD 和 DS）和电离状态，如前所述。

图4

构象动力学

图 5 a-c给出了 CM2CS2 系统的每个连接的 FEL（自由能图）以及在三种pH条件下不同电离状态下相应的优选构象，图5d显示了糖苷键从非还原端到还原端的序列号和分布。优选的构象是从所有链接都处于全局最小能量（深蓝色）的共同轨迹中提取的，因此代表数量最多的（φ，ψ）分布和最稳定的结构。FEL图中的白色区域是本工作中自由能高于20 kJ·mol-1的不利或不可获得的结构，其他浅能盆地代表MD模拟期间的亚稳态结构构象。

图5

对于酸性条件下的CM2CS2（图5a），所有四个连接处的φ二面角在-60°左右的FEL上采用全局最小值，而ψ二面角可以在-180°到+180°的整个范围内变化. 这种行为表明糖苷键向非还原端的旋转非常受限，而向还原端的旋转则非常动态。这是由于糖苷键周围的轨道-轨道相互作用(exo-anomeric效应)，显示出对非还原端糖苷键的稳定作用（Skovstrup等人，2010）。较大的 ψ 波动决定了整条链的高构象自由度，造成单条链的扭曲和多条链的扭曲堆叠。似乎单个链是最终自组装结构的构建块。此外，可以在单个链中找到–COOH 和–NHC=O之间的分子内氢键。然而，不足以稳定整个分子链，并且由两个侧链上的基团形成的这种氢键不能限制主链的旋转。因此，酸性条件下的分子链是柔韧的。当与其他链相互作用时，-COOH基团之间的分子间氢键占主导地位，以稳定密集的聚集体。图5 b 显示了 CM2CS2 在中性条件下的 FEL。类似地，几乎不变的 φ 二面角以及可变的 ψ 二面角表明存在链上稳定的exo-anomeric效应。然而，φ二面角在-120°附近有较高值，表明CMCS在中性条件下的链结构更加拉伸。对于碱性条件下的 CM2CS2（图5c），exo-anomeric效应也导致了 -120° 附近的受限 φ 二面角。

在这项工作中，进行了一系列 MD 模拟以研究 CMCS 分子在水溶液中的动态聚集行为。模拟结果表明，不同的CMCS可以自组装成不同的聚集结构。中性条件下采用交错堆积，聚集作用更强、更稳定，碱性条件下平行堆积，酸性条件下通过扭曲堆叠。此外，结构差异决定了聚集程度：较高的DD和DS导致中性和碱性条件下的聚集较弱；同时在酸性条件下导致更强的聚集。随着 DD 和 DS 的增加，在中性和碱性条件下，较低的静电势和氢键对减少聚集起主导作用。然而，在酸性条件下，随着DD和DS的增加，聚集的增加主要由分别在-COOH 和 -NH3+基团之间以及-COOH 基团之间形成的分子间氢键控制。作者还通过 SASA 计算考虑了疏水相互作用，这是碱性条件下的主要稳定作用。此外，分子内氢键和exo-anomeric效应可以稳定单个链，这对于它们作为构建单元的组装结构起着重要作用。

参考文献：

Carbohydrate Polymer 2022, 297, 119993

https://doi.org/10.1016/j.carbpol.2022.119993.