河豚毒素的研究进展

背景及概述

河豚的鱼肉鮮嫩味美，帶有肉刺的鱼皮，胶质浓厚，食之黏口，味觉美感远胜于鱼翅、海参，因此被誉为“长江三鲜”之首。但河豚大都含有河豚毒素(tetrodotoxin，TTX)，毒素集中于卵巢、肝脏、肾脏、血液、眼睛、鱼鳃及皮肤中。河豚毒素比较稳定，用盐腌、日晒、一般加热烧煮等方法都不易消除。1990年我国出台的《水产品卫生管理办法》明文规定：河豚鱼有剧毒，不得流入市场。河豚毒素是一种弱碱性动物生物碱，为非蛋白质神经毒素。

河豚毒素的结构与性质

河豚毒素的化学研究始于1909年，1964年以后由Woodward测定了TTX的结构，1972年Kishi等采用化学方法成功合成了河豚毒素。河豚毒素分子式为C11H17N3O8，分子量为319.27。分子主要由3个氮原子组成，它们与氢氧原子形成特殊的结构。含有1个碳环，1个胍基，6个羟基，在C-5和C-10位有一个半醛糖内酯连接着分开的环。有专家将其称为“自然界最奇特的分子之一”，也是世界上最致命的毒药之一。1g河豚毒素的毒性是1g氰化物的1万倍。TTX粗制品为棕黄色粉末，纯品为无色晶体，呈针状或菱形，无臭，无味，易吸湿潮解，不溶于无水乙醇、乙醚、苯等有机溶剂，微溶于水，极易溶于稀酸水溶液。TTX在溶液中存在TTX、半缩醛型TTX、内酯型TTX动态平衡的三种结构。TTX理化性质比较稳定，在中性和酸性条件下对热稳定，240℃开始碳化，但300℃以上也不分解。在碱水溶液中易分解，在5%氢氧化钾溶液中于80℃～100℃可分解成黄色结晶2-氨基-6-羟甲基-8-羟基-喹唑啉，这也是TTX化学检测法的理论基础。

河豚毒素的来源

河豚毒素可从多种动物中检测得到，并非河豚所特有的。那究竟河豚毒素从何而来?目前主要有内因说和外因说两种。Matsumura[4]等用授精法从河豚鱼卵母细胞发育的胚胎中发现河豚毒素的毒性随胚胎发育不断增高，提出TTX是河豚鱼胚胎的产物，但没有更多证据证实这种说法。外因说即所谓的食物链假说和微生物起源假说。YujiNagashima[5]等通过用不同的豚鱼肝脏切片进行试验。肝脏切片在河豚毒素浓度为25μg/mL的培养基中孵育，检测河豚毒素的积累表明了在河豚鱼和豚鱼肝脏间河豚毒素的累积是不同的，它们的不同并不在于河豚毒素的分泌能力，而在于它的吸收能力。河豚毒素的体外积累实验支持了外因说这一观点。虽然河豚毒素的起源问题一直存在争议，目前为止研究人员并没有在河豚鱼体内找到可分泌毒素的腺体和导管，但已从海洋细菌的发酵产物中检测得到河豚毒素及其类似物。认为河豚毒素来源于摄食。研究人员认为食物链是河豚毒素的主要积累途径。为了证明它的起源，研究了几种耐河豚毒素的生物体，从中分离出几种肠道细菌，并证明某些肠道细菌确实能产河豚毒素，推断海洋中河豚毒素的最初生产者是这些海洋细菌。此外，通过浮游动物经食物链传递、或寄生(共生)等途径来积累河豚毒素的实验，证实了遵循食物链中越高级的生物有着越高浓度的河豚毒素的原则。这个假说也通过用非毒性河豚鱼由于喂养含河豚毒素的饲料而中毒的事实得到证明。

河豚毒素的作用机制

1982年，美国植物学家韦德-戴维斯发现，海地巫毒教中的回魂大师在药物中使用含有从河豚提取的毒素粉末，整个过程里中毒者大脑能完全保持清醒，如果能挺过24h，他们就会很快恢复正常，且不会出现并发症。使人们相信他们有使人“死而后生”的能力，即所谓的“还魂术”。其实，这是由于河豚毒素的特殊结构使其像塞子一样，凝固在神经轴突的钠离子通道的入口处，阻碍钠离子透过细胞膜传导神经的冲动，从而关闭神经系统。由于河豚毒素不能越过大脑中血液细胞的屏障，因此受害者就会处于大脑清醒的无助状态之中。几小时或几天过后，当河豚毒素最终开放钠离子通道时大多数受害者已经死亡。TTX是典型的钠离子通道阻断剂，它能选择性与肌肉、神经细胞的细胞膜表面的钠离子通道受体结合，阻断电压依赖性钠离子通道，从而阻滞动物电位，抑制神经肌肉间兴奋的传导，导致与之相关的生理机能的障碍，主要造成肌肉和神经的麻痹。构效关系表明，TTX的活性基团是1，2，3位的胍氨基和附近的C-4，C-9，C-10位的羟基，胍基在生理pH值下发生质子化，形成正电活性区域与钠离子通道受体蛋白的负电性羰基相互作用，从而阻碍离子进入通道。河豚毒素能够麻痹人的肌肉和神经，而对河豚鱼自身没有影响。日本专家认为，这是因为河豚肌肉细胞的结构和人的不同，研究人员对河豚肌肉表面收容体的遗传基因进行分析，发现其中氨基酸的种类和人类的不同，河豚的这些氨基酸不与河豚毒素结合。除此以外，研究人员还发现河豚血液中有可以中和河豚毒素的蛋白质。

河豚毒素的提取

TTX的提取方法主要有乙酸提取或改良乙酸提取、树脂提取和甲醇提取等。目前，我国TTX提取常用的方法是从河豚鱼体不同部位提取纯化TTX，一般工艺流程为[1]：河豚鱼→水，乙酸等浸提→除蛋白质、脂类→离子交换等方法分离→脱色→活性炭吸附、聚丙烯酰胺层析等方法纯化→浓缩、精制→结晶，此法TTX的提纯难达到试剂级的高精水平。由于很多文献报道TTX多克隆抗体能够与TTX特异性结合，中和其毒性，因此可以考虑将TTX多克隆抗偶联于载体制成免疫亲和层析介质，再对TTX进行纯化，简化其提取工艺，提高TTX产率。由于大量捕杀河豚鱼受到资源和时空的限制，破坏了河豚鱼资源，甚至导致生态平衡的破坏，所以人们不得不另辟蹊径。根据河豚毒素的微生物起源，分离出产河豚毒素的微生物类群，通过微生物发酵来产生河豚毒素。产TTX的微生物类群有弧菌属(Vibrio)的溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)和鳗弧菌(Vibrioanguillarum)，假单胞菌属(Pseudomonas)，希瓦氏菌属的腐败希瓦菌芽孢杆菌属(Bacillus)，链霉菌属(Streptomyces)，其中产毒力较高的主要是溶藻弧菌和河豚毒素互生单胞菌(Alteromonastetrodonis)[8]。但微生物产河豚毒素产量非常低，仅为ng级。由于其产生机制尚不清楚，提高其产量及其纯化方法也是一个难题。

参考文献

[1] 郭慧清, 刘渝洲, 王红雨, 等 . 联合采用吸附树脂与离子交换树脂提取河豚毒素 [J]. 广州师院学报: 自然科学版, 1997 , 2:60- 63