河豚毒素的作用机制

背景及概述^[1][2]

河豚大约是500种海洋有毒性鱼类中，人畜受其毒害最为常见者，如刺鲀科(Procupine fish，10种)、翻车鲀科(Sunfich，1种)、鲀科(Puffers，40种)。中国沿海分布有10余种，各地俗称“小玉斑”、“大玉斑”、“乌狼”、“䱓鲅”、“腊头”、“乘鱼”、“鸡泡”等。中国东汉张仲景(约公元200年)所著《金匮要略》明确指出河豚的毒性。后于《本草纲目》中对海洋毒素的研究，已取得显著成就。河豚体内所含的毒素。是一种多羟基全氢甲基喹唑啉的复杂化合物。元素组成大约是C_10-12H_15-19O_8-10N₃，弱碱性，无色结晶。小鼠致死剂量LD₅₀为5×10^-9-10×10^-9，，对中等体重的人0.3毫克在1-2小时内即会死亡。河豚毒素一般存在于血液、卵巢、皮肤、肝脏之内。但双斑圆鲀等的肌肉内也含强毒，暗色东方鲀肾脏毒性最强。河豚毒性随季节而异，冬春之交毒性最强。幼鱼毒性不亚于成年鱼。河豚毒素稳定，盐腌、日晒、一般烧煮均不能解毒，若与无毒鱼混腌，无毒鱼亦能被其毒素污染。河豚毒素作用于神经中枢，会导致呼吸循环衰竭。河豚毒素有抗癌作用，是癌症后期的治疗药物。100千克河豚卵巢可制取河豚毒素1-2克。其提取过程是：水提取物煮沸、过滤、层析，用10%乙酸洗脱。洗脱液用活性炭吸附，再用稀乙酸洗脱，洗脱液河豚毒素结晶沉淀。

结构及性质^[2]

河豚毒素(TTX)的化学研究始于1909 年，1964 年以后由Woodward 测定了TTX 的结构，1972 年Kishi 等采用化学方法成功合成了河豚毒素。河豚毒素分子主要由3 个氮原子组成，它们与氢氧原子形成特殊的结构。其结构含有1 个碳环，1 个胍基，6 个羟基，在C—5 和C—10位有一个半醛糖内酯连接着分开的环。有专家将其称为“自然界最奇特的分子之一”，也是世界上最致命的毒药之一。1 g 河豚毒素的毒性是1 g 氰化物的1 万倍。TTX 粗制品为棕黄色粉末，纯品为无色晶体，呈针状或菱形，无臭，无味，易吸湿潮解，不溶于无水乙醇、乙醚、苯等有机溶剂，微溶于水，极易溶于稀酸水溶液。TTX 在溶液中存在TTX、半缩醛型TTX、内酯型TTX动态平衡的三种结构。TTX 理化性质比较稳定，在中性和酸性条件下对热稳定，240 ℃开始碳化，但300 ℃以上也不分解。在碱水溶液中易分解，在5%氢氧化钾溶液中于80 ℃～100 ℃可分解成黄色结晶2- 氨基- 6- 羟甲基- 8-羟基-喹唑啉，这也是TTX 化学检测法的理论基础。

作用机制^[2]

1982 年，美国植物学家韦德- 戴维斯发现，海地巫毒教中的回魂大师在药物中使用含有从河豚提取的毒素粉末，整个过程里中毒者大脑能完全保持清醒，如果能挺过24 h，他们就会很快恢复正常，且不会出现并发症。使人们相信他们有使人“死而后生”的能力，即所谓的“还魂术”。其实，这是由于河豚毒素的特殊结构使其像塞子一样，凝固在神经轴突的钠离子通道的入口处，阻碍钠离子透过细胞膜传导神经的冲动，从而关闭神经系统。由于河豚毒素不能越过大脑中血液细胞的屏障，因此受害者就会处于大脑清醒的无助状态之中。几小时或几天过后，当河豚毒素最终开放钠离子通道时大多数受害者已经死亡。TTX 是典型的钠离子通道阻断剂，它能选择性与肌肉、神经细胞的细胞膜表的钠离子通道受体结合，阻断电压依赖性钠离子通道，从而阻滞动物电位，抑制神经肌肉间兴奋的传导，导致与之相关的生理机能的障碍，主要造成肌肉和神经的麻痹。构效关系表明，TTX 的活性基团是1，2，3 位的胍氨基和附近的C—4，C—9，C—10 位的羟基，胍基在生理pH 值下发生质子化，形成正电活性区域与钠离子通道受体蛋白的负电性羰基相互作用，从而阻碍离子进入通道。

河豚毒素能够麻痹人的肌肉和神经，而对河豚鱼自身没有影响。日本专家认为，这是因为河豚肌肉细胞的结构和人的不同，研究人员对河豚肌肉表面收容体的遗传基因进行分析，发现其中氨基酸的种类和人类的不同，河豚的这些氨基酸不与河豚毒素结合。除此以外，研究人员还发现河豚血液中有可以中和河豚毒素的蛋白质。

应用^[2]

河豚毒素有着特殊结构和作用机理，引起了人们的广泛关注。神经生物学家证实微量毒液就有治疗作用。河豚毒素也可作为局部麻醉药，其局部麻醉作用比一般麻药强。国外已有将河豚毒素与普通麻药配伍作为局部麻药的专利出售。河豚毒素对癌痛的镇痛也很有效。研究人员发现癌症病人24 h 持续杜冷丁治疗收效甚微，而注射河豚毒素，每天2 次，连续3 天疼痛便缓解。河豚毒素不仅可以有效缓解晚期癌症引起的剧烈痛楚，还可治疗顽固性哮喘等。我国研究人员发现，河豚毒素还是一种戒毒良药。研究人员对吸毒者进行试验，在注射极微量的河豚毒素后，所有各种“戒毒综合症”在30 min 后全部消失。连续注射5 d 后可完全戒除毒瘾，且没有副作用。1998年，加拿大国际韦克斯技术公司利用河豚毒素成功研制成一种名为tetrodin 的戒毒新药。利用河豚毒素来戒除毒瘾，可谓“以毒攻毒”的一大创举。目前河豚在我国的养殖产量每年达到1 至1.5 万t，年产值10 至20 亿元，加工后的附加值提高5 至10 倍。但人们养殖河豚鱼仅仅限于食用，追求无毒，实际上河豚毒素的市场需求量更大，而且河豚毒素本身的特点使其价值极为昂贵。据报道每克纯度达99 %以上的河豚毒素价值高达20 万美元，甚至还有上升的趋势。一旦国家开禁，河豚未来在中国的市场将成为全球的市场，河豚毒素的应用前景也将更为广阔。

解毒^[2]

河豚毒素的解毒现在还没有找到特异性的药物。但对于TTX 中毒者可用新鲜余甘果汁解毒。研究者将肝毒稀释5 倍注射小鼠，然后同时注射2 mL 新鲜余甘果汁，小鼠未死亡； 对照组小鼠在125 s 左右死亡。实验证明余甘果汁有解毒功效，可能是新鲜余甘果汁中的超氧化物岐化酶(SOD)起解毒功效。也可注射S- P 剂(即亚硫酸氢钠和磷酸的混合液)，据研究表明河豚毒素分子中的内酯环是毒性的成因，内酯环断裂则毒性消失，S- P 试剂对内酯环有破坏作用。试验中向河豚鱼毒液中加入适量的S- P 试剂注射后的小鼠未死亡。用小鼠死亡时间评价碳酸氢钠等5 种化合物拮抗河豚毒素效果，结果表明碳酸氢钠和氢溴酸东莨菪碱对河豚毒素有明显的拮抗作用，可使小鼠100 %或80 %存活(P<0.01)。最近有多个研究表明，4- 氨基吡啶对TTX 中毒有拮抗作用。

4- 氨基吡啶的毒副作用和安全剂量范围小，能否用于临床救治还需要进一步证实。利用TTX 单克隆抗体对TTX 中毒亦具有较好的保护作用。将TTX( 5MU/mL) 与单抗在体外等体积混合，并于37 ℃孵育60 min 后再给小鼠腹腔注射，结果表明注射含0.125 mg 单克隆抗体的小鼠存活率为40 %，注射含0.25 mg 单克隆抗体的小鼠存活率达100 %。用TTX 单克隆抗体对小鼠TTX 中毒的保护作用作了进一步研究，证实这种保护作用在TTX 与抗体分别注射的情况下也存在。75 mg/kg单克隆抗体对小鼠TTX 中毒的保护率达50%。小鼠腹腔注射1.5MU TTX，3 min 后再注射克隆抗体，通过静脉，皮下，肌肉注射中和小鼠体内TTX 的单克隆抗体的半数有效剂量( ED50) 分别为2.3、5.1、9.7 mg/kg。100 μg 单抗尾部静脉注射保护率为100 %。这种与TTX 中毒相似条件下得到的研究结果充分说明了TTX单克隆抗体对小鼠TTX 中毒的保护作用，同时也预示着TTX 单克隆抗体有望成为TTX 中毒的解救剂。但由于TTX 是小分子物质，其抗体制备相对困难，临床应用受到了限制。TTX 的多克隆抗体同样对TTX 中毒有保护作用。用TTX- TTH 免疫小鼠的腹水抗体检测其中和河豚毒素的效用。证实了抗体能够在体内外有效中和河豚毒素的毒性。此抗体有望成为人类河豚毒素中毒的被动免疫保护途径。

检测^[3]

除上面比较常规的方法外，国内报道的还有分光光度计法、薄层层析法、高效毛细管区带电泳法等方法。国外报道的还有柱转换液相色谱/质谱/电喷雾法、薄层层析/快原子轰击质谱法、亲水作用色谱-电喷雾质谱法、电喷雾离子化质谱法等方法，这些方法简单精确但是所需仪器设备都比较昂贵，不便于普遍推广。目前河豚毒素的检测方法多种多样，各有优缺点，应根据需要选择合适的检测方法。

制备 ^[2]

TTX 的提取方法主要有乙酸提取或改良乙酸提取、树脂提取和甲醇提取等。目前，我国TTX 提取常用的方法是从河豚鱼体不同部位提取纯化TTX，一般工艺流程为： 河豚鱼→水，乙酸等浸提→除蛋白质、脂类→离子交换等方法分离→脱色→活性炭吸附、聚丙烯酰胺层析等方法纯化→浓缩、精制→结晶，此法TTX的提纯难达到试剂级的高精水平。由于很多文献报道TTX 多克隆抗体能够与TTX 特异性结合，中和其毒性，因此可以考虑将TTX 多克隆抗体偶联于载体制成免疫亲和层析介质，再对TTX 进行纯化，简化其提取工艺，提高TTX 产率。由于大量捕杀河豚鱼受到资源和时空的限制，破坏了河豚鱼资源，甚至导致生态平衡的破坏，所以人们不得不另辟蹊径。根据河豚毒素的微生物起源，分离出产河豚毒素的微生物类群，通过微生物发酵来产生河豚毒素。

产TTX 的微生物类群有弧菌属(Vibrio)的溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)和鳗弧菌(Vibrioanguillarum)，假单胞菌属(Pseudomonas)，希瓦氏菌属的腐败希瓦菌(Shewanella putrefy aciens)，交替单胞菌(Alteromonas)，芽孢杆菌属(Bacillus)，链霉菌属(Streptomyces)，其中产毒力较高的主要是溶藻弧菌和河豚毒素互生单胞菌(Alteromonas tetrodonis)[8]。但微生物产河豚毒素产量非常低，仅为ng 级。由于其产生机制尚不清楚，提高其产量及其纯化方法也是一个难题。

主要参考资料

[1] 海洋大辞典

[2] 河豚毒素的研究进展

[3] 河豚毒素的理论及应用研究进展