粘质沙雷伯氏菌的应用

背景^[1][2]

灵菌红素( Prodigiosin，PG) 是一种重要的天然红色素，在医药、化工、染料等行业具有较大的应用前景。1977 年首次验证了PG 的体内抗肿瘤作用，发现粘质沙雷氏菌( Serratia marcecens) PG 提取物能诱导血癌细胞的凋亡。目前较受关注的PG 衍生物GX15-070，作为多种癌症的备选治疗药物，已进入临床II 期研究阶段。作为灵菌红素家族中的一员，PG 主要是一些沙雷氏菌属、放线菌属、假单胞菌属、海洋类细菌等的次生代谢产物。

粘质沙雷氏菌是PG 的主要生产菌株，它属于肠杆菌科、沙雷氏属的一个种，为革兰氏阴性短杆菌，形态上一般比其它肠道菌小，无荚膜。该菌属中能产灵菌红素的菌株属于温度敏感型表型： 在温度低于30℃ 时产红色素，高于37℃时不产红色素，但是其受温度调控的具体原因尚不明确。

早期研究发现，粘质沙雷氏菌合成PG 的前体物质主要有脯氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、丝氨酸、组氨酸、二辛烯醛、丙二酰-CoA 和乙酰-CoA 等；PG 合成基因簇包括16 个基因，其中pigA-pigN(共14 个基因) 是灵菌红素合成的编码基因；cueR和copA 是其调控基因，PG 是通过双歧途径合成的，它由两个单体2-甲基-3-n-戊基( MAP) 和4-甲氧基-2，2’-双吡咯-5-甲醛( MBC) 经缩合酶( PigC) 缩合而成，其中MAP 的合成由PigB /PigD /PigE 参与，而MBC 的合成由PigA /PigF /PigG /PigH /PigI /PigJ /PigK /PigL /PigM/PigN 参与。

应用^[1][2][3]

粘质沙雷氏菌主要用于生产灵菌红素。灵菌红素是具有三个吡咯环骨架结构的天然红色素，具有抗细菌、真菌、疟疾和霉菌、抗病毒、免疫抑制和抗肿瘤等作用。作为一种新的天然抗癌待药物，灵菌红素已逐渐成为国内外癌研究的热点之；而微生物发酵生产的灵菌红素更是比较理想的天然色素，因此该色素具有很好的应用前景。

在自然界，温度对粘质沙雷氏菌很重要，但是目前很难给出细菌学和生态学的解释；粘质沙雷氏菌的生存温度范围比较宽泛( 20-40℃) ，但PG 的合成却需要相对严格的温度( 24-28℃) ，其中28℃是PG 合成的最适温度，同样的，粘质沙雷氏菌合成PG受温度调节机制目前仍不清楚。有实验研究了粘质沙雷氏菌( Serratia marcecens JNB5-1) 在不同发酵温度( 28℃和37℃) 条件下蛋白质组的差异表达，探究粘质沙雷氏菌合成灵菌红素受温度调控的原因。

方法利用二维凝胶电泳( 2-DE) 和基质辅助激光解析电离飞行时间串联质谱技分离和鉴定粘质沙雷氏菌在不同发酵温度( 28℃和37℃) 条件下的差异蛋白； 再利用实时荧光定量PCＲ( ＲT-qPCＲ) 进一步分析挑选出的七个差异蛋白编码基因的转录水平。

结果显示，灵菌红素合成途径中的氧甲基转移酶( PigF) 、氧化还原酶( PigN) 和参与灵菌红素前体物质( 脯氨酸、甲硫氨酸、丝氨酸、二辛烯醛和丙二酰-CoA 等) 代谢的相关蛋白( 酶) 的表达量在37℃ 条件下都出现极显著的下降； 热休克蛋白( Hsp60) 、超氧化物歧化酶( Superoxide dismutase) 等应急性蛋白在37℃条件下表达上调。

通过ＲT-qPCＲ 证实，氧甲基转移酶、氧化还原酶和转酮醇酶基因( transketolase) 在37℃条件下的转录水平均低于28℃条件下。粘质沙雷氏菌在相对低温( 28℃) 条件下产灵菌红素，相对高温( 37℃) 件下不产灵菌红素。可能是高温( 37℃) 显著抑制了灵菌红素合成相关酶的表达。

此外，还有研究表明粘质沙雷氏菌菌株PS−1对甜菜夜蛾种群增长的具有抑制作用。甜菜夜蛾Spodoptera exigua Hübner 是一种多食性、间歇性大发生的害虫，近年来尤以蔬菜和棉花受害最重。使用化学农药是防治甜菜夜蛾的主要方法，结果导致甜菜夜蛾的抗药性不断提高，用药量不断增加，农产品品质受到严重影响。

为了提高农产品的产量和品质、保护人民健康，研究和开发甜菜夜蛾生防菌资源具有重要意义。粘质沙雷氏菌Serratia marcescens 由于其对多种农业害虫的高致病性和对害虫的巨大潜力而受到国内外学者的广泛关注。有研究测定了粘质沙雷氏菌菌株PS-1 对甜菜夜蛾的致病力及其试验种群增长的抑制作用。用菌株PS-1 菌悬液与人工饲料混配饲喂甜菜夜蛾2 龄幼虫48 h，对其幼虫的存活有明显的抑制作用，对其蛹和成虫有明显的后致死作用。

在2×101～2×108 cfu/g 的浓度范围内，有明显的浓度效应。随着处理浓度的升高，甜菜夜蛾幼虫的死亡率明显提高，蛹的存活率明显降低，成虫产卵量明显减少，其试验种群的增长分别比对照降低了74.4%～100%。用浓度为1×103、1×105 和1×107 cfu/mL的PS-1菌悬液分别配制成10%蜂蜜水饲喂甜菜夜蛾成虫2 d，各浓度处理组成虫的寿命分别比对照缩短了5.70、5.91 和7.16 d，产卵量也明显减少。

用浓度为1×109 cfu/mL 的PS-1 菌悬液离心后，取上清液加入到人工饲料中饲喂甜菜夜蛾2 龄幼虫48 h，幼虫8 d 累积死亡率达70.0%，显著高于对照。用组建生命表的方法评价了菌株PS-1 对甜菜夜蛾的全面作用，该菌株对甜菜夜蛾试验种群增长的抑制作用，主要是其抑制了甜菜夜蛾幼虫和成虫的存活率以及成虫的生殖力。这些结果为甜菜夜蛾的生物防治和粘质沙雷氏菌PS-1的进一步开发利用提供了依据。

粘质沙雷氏菌还可生产D-乳酸。有研究以粘质沙雷氏菌G1(Serratia marcescens G1)为出发菌种，摇瓶试验确定了发酵培养方式：前12 h为菌体生长阶段，有氧培养，温度28℃，pH值7.0；后36 h为D-乳酸合成积累阶段，无氧培养，温度44℃，pH值6.0。且发现使用葡萄糖为碳源时更有利于D-乳酸的合成积累。

采用缺失2，3-丁二醇合成能力的基因工程菌株R1为出发株，经筛选后得到耐受较高浓度乳酸盐的菌株R150，以R150为发酵菌种，在3.7 L发酵罐上采用两阶段发酵法，并通过增加起始菌体浓度的方法，发酵生成的D-乳酸浓度达到83.5 g/L，光学纯度达到98.9%。本研究成果为使用粘质沙雷氏菌发酵生产D-乳酸的深入研究打下了基础。

主要参考资料

[1] 徐虹, 徐美娟, 杨套伟, 等. 温度对粘质沙雷氏菌合成灵菌红素的影响[J]. 微生物学报, 2014, 54(5): 517-524.

[2] 季秀玲, 林连兵, 张琦, 等. 粘质沙雷氏菌的分离鉴定及产红色素培养基的优化[D]. , 2014.

[3] 杨建云, 曹溪, 纪春艳, 等. 粘质沙雷氏菌菌株 PS-1 对甜菜夜蛾种群增长的抑制作用[J]. 中国生物防治学报, 2015, 31(4): 501-507.