为何替加环素对铜绿假单胞菌无效？

一、铜绿假单胞菌

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）又称绿脓杆菌，是引起急性或慢性感染的最常见的条件致病菌之一，由其引起的院内感染往往治疗难度极大，几乎具有目前已知的细菌主要耐药机制，已成为引起院内获得性肺炎多重耐药革兰阴性菌的代表，PA 感染是治疗的难题，归其原因，在于其广泛而多重的耐药性[1]。

微生物耐药机制类型[2]

1、微生物常见的抗生素耐药机制（下图）包括：（1）降低细胞膜通透性；（2）水解酶溶菌/灭活药物；（3）药物修饰；（4）细胞靶点突变，使抗生素不能有效地与特定靶点结合；（5）通过跨膜外排泵系统主动排出药物；（6）药物抑制。

2、主动外排是细菌将有害物质（包括抗生素）排放到细胞外的现象，也是引起MDR的主要方式，这个过程涉及到外排系统对外排底物的识别、固定和输送。根据氨基酸序列同源性和底物特异性，一般将这些外排泵分为5大类（下图）：

1）多药及毒性化合物外排分子家族（multi-antimicrobial and toxic compound extrusion，MATE）；

2）小多重耐药转运分子家族（small multidrug resistance family，SMR）；

3）ATP结合盒超家族（ATP-binding cassette superfamily，ABC）；

4）主要促进剂超家族（major facilitator superfamily，MFS）；

5）耐药性结节化细胞分化分子家族（resistance nodulation division family，RND）。

3、作用机制

1）MATE是由质子势能和钠离子浓度梯度共同提供能量将药物泵出胞外；

2）SMR是转运蛋白利用质子交换驱动药物外排，EmrE是其代表成员之一；

3）ABC利用NBD水解ATP为细胞跨膜转运提供能量；

4）MFS是利用胞内外的质子浓度梯度提供的化学势能为跨膜转运供能；

5）RND是外膜蛋白（OMP）与内膜蛋白（IMP）形成转运通道，二者与周质膜融合蛋白（MFP）相互作用，促使外排泵系统形成稳定结构，从而实现药物外排。

RND泵表现出广泛的特异性，其三部结构允许将化合物直接从细胞质挤压到外部环境。三部结构分别为

膜融合蛋白或连接蛋白（MFP）：MexA、MexC、MexE、以及MexX，

内膜蛋白（IMP）：MexB、MexD、MexF以及MexY，

外膜通道蛋白（OMP）：OprM、OprJ、以及OprN。

其中研究较多的有4种类型：MexAB-OprM 、 MexCD-OprJ 、MexEF-OprN、和MexXY-OprM。

二、替加环素

替加环素 (Tigecycline， GAR 936) ，又称甘氨酞环素 (glycylcycline)，是继多西环素、米诺环素、美他环素后开发的新一代四环素类抗生素，为个甘氨酰环类抗菌药物，为米诺环素衍生物。通过与核糖体 30 S 亚单位结合、阻止氨酰化 tRNA 分子进入核糖体 A 位而抑制细菌蛋白质合成，同时阻止了肽链因合并氨基酸残基而延长。与四环素相比，在中央的骨架的侧链上，在第9位以D环甘氨酰环代替了 N2烷基2甘氨酰氨基。使抗菌谱更广，抗菌活性更强，而且使它得以能克服大多数细菌对四环素耐药机制的产生。

替加环素在体外对大多数细菌革兰氏阳性与革兰氏阴性需氧与厌氧菌，包括金黄色葡萄球菌、肠球菌、肺炎球菌、流感嗜血杆菌、粘膜炎莫拉菌、淋球菌、消化链球菌属、梭状芽胞杆菌、拟杆菌有很好的抗菌活性。但对铜绿假单胞菌、普通变形杆菌、洋葱伯克霍尔德菌无抗菌活性，对吲哚阳性的变形杆菌族与奇异变形杆菌仅能起抑制作用[4-5]。

三、PA对替加环素的耐药机制[3]

1、PA对替加环素的天然抗性，是由MexXY-OprM外排泵介导的

通过研究发现，在没有删除任何基因片段的条件下，铜绿假单胞菌（K767株）对替加环素的敏感度很差（MIC＞8mg/l）。以往的研究表明，通常情况下，PA通常不会产生MexCD-OprJ 和 MexEF-OprN这两种外排泵，因此这两种外排泵不会参与PA的耐药。而MexAB-OprM在天然情况下会产生，但是通过表2可以得知，被删除了mexB基因片段了的PA（K1523株）对替加环素依然耐药。MexXY基因的表达，需要通过多种抗菌药物（包括替加环素）的诱导。删除mexXY基因后的PA（K1525株），表现除了对替加环素敏感性的显著增加，表明MexXY介导的外排泵可显著性降低PA对替加环素的敏感性。与mexAB-oprM、mexCD-oprJ和mexEF-oprN不同，mexXY基因座没有编码外膜成分的相关基因。一些证据表明MexAB-OprM外排泵的OprM成分为铜绿假单胞菌的MexXY提供了外膜通道功能。表2显示，删除了mexAB-oprM基因的PA（K1119株）与删除了mexXY基因的PA（K1525株）对替加环素的有相同的敏感性，而仅有mexB基因丢失的PA（K1523株）对替加环素的敏感性并没有明显增加。因此，强烈表明了oprM与MexXY介导的外排泵与PA的耐药性有特异性关联，有力地支持了oprM与MexXY是共同作用的外膜通道的观点。

2、替加环素、四环素可诱导PA产生Mex X、Mex Y基因

给予不同浓度的替加环素，发现在1μg/ml时，mexX、mexY分别有13.43和12.85倍的表达，四环素在4μg/ml时，也表现出同样的结果，表明尽管它们两者的结构不同，但都是mexXY强诱导剂。这也表明四环素及其衍生物诱导MexXY外排泵的表达是在转录水平上介导的。但是，不同浓度都不能使oprM表达增强，表明编码MexXY-oprM泵外膜通道成分的oprM的转录并不是由替加环素或四环素诱导的。

3、PA获得性耐药

为了测试MexXY的特异性抑制可能有助于将替加环素的活性扩展到包括铜绿假单胞菌的可能性，将MexXY-oprM完全被抑制的PAO1-MexXY（K1525）、mexB/MexXY（K1542株）和mexAB-oprM（K1119）菌株放在含有4或6μg/ml替加环素的L-琼脂平板上，发现三株菌种很快就产生了对该浓度替加环素具有抗性的自发突变体。来自每个亲本菌株的两个代表性突变体（来自mexXY突变体菌株的XY1和XY3，来自mexB/mexXY突变体菌株的BXY1和BXY4，以及来自mexAB oprM突变体菌株的M1和M9）的敏感谱如表2所示。每个突变体对替加环素的敏感性都降低到了铜绿假单胞菌（野生型）的固有水平，且表现出多药耐药表型，表明外排泵参与获得性耐药的可能性。也表明即使缺少了MexXY-OprM外排泵，PA也能产生替代性的外排泵以迅速对替加环素发生耐药，说明特异性抑制MexXY不能提高替加环素对PA敏感性。

4、替加环素也是MexAB-OprM的作用底物

在缺乏了mexXY基因后，突变菌株XY3对替加环素的敏感性也降低，研究发现是出现了过度表达MexAB-OprM，表明替加环素也是MexAB-OprM的底物。而MexAB-OprM对替加环素的显著外排似乎仅在没有MexXY的情况下发生，这意味着当两个泵都存在时，替加环素优先被MexXY-OprM识别。

5、替加环素也是MexCD-OprJ的作用底物

突变株XY1来源于缺失了mexXY的K1525株，与突变株XY3的不同之处在于它不表现出对羧苄青霉素的耐药性（表2）。突变体BXY1、BXY4、M1和M9（表2）在耐药性方面似乎都与XY1属于同一类，对氯霉素和头孢吡肟有很高的耐药性，对羧苄青霉素的敏感性增加，提示存在MexCD-OprJ介导的外排。BXY1和M1对替加环素的敏感性降低是由MexCD-OprJ介导的，但是MexCD-OprJ在外排替加环素方面可能不如MexXY-OprM有效。

6、外排甘氨酰环素

比较多西环素、米诺环素、四环素、替加环素以及三种新型甘氨酰环素对原生型、基因删除型、突变型PA菌株的敏感谱发现（表4），缺失了mexAB-oprM的PA菌株（K1119），因缺乏mexAB-oprM和MexXY-oprM外排泵的作用，与比原生型菌株（K767株）相比对四环素的敏感性增强（MIC均≤0.5 mg/l）。菌株K1525因mexXY基因的特异性缺失，对甘氨酰环素的敏感性与缺失mexAB-oprM基因菌株（K1119）类似，而对非甘氨酰四环素（米诺环素、多西环素、西环素）的敏感性则小得多（MIC≥4mg/L）。被删除了mexXY和mexB基因的菌株（K1542）增加了对非甘氨酰四环素的敏感性，情况与mexAB-oprM菌株（K1119）相似。因此，米诺环素和多西霉素主要由MexAB-OprM排出，少量由MexXY-OprM排出。替加环素、DMG-MINO、DMG-DMDOT和PAM-MINO的外排由MexXY-OprM主要负责，MexAB-OprM在其中的作用似乎较少。

删除了mexXY基因后的突变菌株XY3，代偿性的产生了MexAB-OprM外排泵，导致对米诺环素和多西环素的敏感性降低，MIC高达64mg/L，而对甘氨酰环素的MIC都没超过8mg/L。类似的情况出现在BXY1和M1菌株，在没有了MexAB-OprM和MexXY-OprM外排泵的情况下，由于MexCD-OprJ外排泵的作用，对多西环素、米诺环素的MIC为128mgL，对甘氨酰环素的MIC在8-16mg/L。因此，表明，MexCD-OprJ外排泵对甘氨酰环素的影响较小。

结 论

1、MexXY-OprM外排泵可降低铜绿假单胞菌对替加环素（和其他甘氨酰环素）的敏感性。抑制MexXY-OprM活性后，很容易引起MexAB-OprM或MexCD-OprJ或可能的其他外排泵的过度表达，进行代偿性外排。与先前四环素特异性外排泵相比，甘氨酰化四环素不能克服RND家族泵的外排，且能诱导先天表达的特定泵的发生相对变化，即从针对半合成四环素的MexAB-OprM转变为针对甘氨酰四环素的MexXY-OprM。

所以，因铜绿假单胞菌具有高表达MexXY-OprM、MexAB-OprM、MexCD-OprJ外排泵，可将替加环素外排至细胞外，所以其对替加环素天然耐药。

有研究显示，应用替加环素后至检出铜绿假单胞菌的中位时间为 11d，因此需要警惕使用替加环素继发的铜绿假单胞菌感染[4]。

参考资料

[1]郑璇儿, 杨杰. 铜绿假单胞菌耐药性的基因学研究进展[J]. 中华实验和临床感染病杂志(电子版), 2014, 000(001):111-113.

[2]Armel, Jackson,  Seukep V , et al. Plant-derived secondary metabolites as the main source of efflux pump inhibitors and methods for identification[J]. Journal of Pharmaceutical Analysis, 2020, v.10(04):5-18.

[3] Dean C R ,  Visalli M A ,  Projan S J , et al. Efflux-mediated resistance to tigecycline (GAR-936) in Pseudomonas aeruginosa PAO1.[J]. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2003, 47(3):972-978.

[4]陈子晞, 王弋. 替加环素治疗中铜绿假单胞菌的定植与感染[J]. 医药导报, 2014, 000(007):911-913.

[5]程仕虎, 王睿. 新一代四环素类药物替加环素的研究进展[J]. 科学技术与工程, 2007, 7(16):4123-4130.