肌苷酸二钠

白色粉末 肌苷酸二钠为无色至白色结晶，或白色结晶性粉末，含约7.5分子结晶水，不吸湿，40℃开始失去结晶水，120℃以上成无水物。味鲜，鲜味阈值为0.025g/100mL，鲜味强度低于鸟苷酸钠，但二者并用有显著的协同作用。当二者以1:1混合时，鲜味阀值可降至0.0063%。与0.8%谷氨酸钠并用，其鲜味阀值更进一步降至0.000031%。溶于水，水溶液稳定，呈中性。在酸性溶液中加热易分解，失去呈味力。亦可被磷酸酶分解破坏。微溶于乙醇，几乎不溶于乙醚。 肌苷酸二钠作为增味剂，营养添加剂 紫外吸光度 用0.01mol/L盐酸配制1/50000试样液，该溶液在波长250nm±2nm处有最大吸收值。A250/A260为1.55～1.65，A280／A260为0.2～0.3。
核糖试验及有机磷酸盐试验均阳性，方法同“02006，5L鸟苷酸二钠”。
钠盐反应阳性(IT-28)。
溶解性 溶于水，微溶于乙醇，几乎不溶于乙醚。． 准确称取试样约500mg，移入1000ml容量瓶内，用0.01mol/L盐酸溶解后定容，混合。取此溶液10.0 ml移入250ml容量瓶中，以0.01mol/L盐酸定容，混合。用0.01mol/L盐酸液作为对照样，在波长250nin处测吸光度(A)，液层宽1crn。试样中肌苷酸二钠(C10H11N4Na2O8P)的含量按下式计算：
肌苷酸二钠含量(%)=A/310×25000/试样量（mg）×100/(100-水分（%）) ×100 ADI不作特殊规定(FAO／WHO，2001)。
LD₅₀14.4g/kg(大鼠，经口)。
0.1%～1.0%饲料量慢性试验饲养大鼠6个月后，体重增加，血浆、肝、肾、脾、睾丸、心、肺等重量及组织均无异常现象。安全性高。可安全用于食品(FDA，§172.535，2000)。
EEC—HACSG规定不得用于婴幼儿食品。 GB 2760—96：各类食品，以GMP为限。
FAO/WHO(1994)：午餐肉、火腿、咸肉等肉类 无色至白色结晶，或白色结晶性粉末。平均含7.5个分子的结晶水。无臭，有特殊滋味。味觉阈值0.012%。不潮解。熔点不明显，180℃时呈褐色，230℃左右时分解。性稳定，在一般食品加工条件下(Ph值为4～7)、100℃加热1h无分解现象。与L-谷氨酸钠对鲜味有相乘效应(如以肌苷酸钠与L-谷氨酸钠之比为1：7，即有明显增强鲜味的效果)。其盐酸溶液的最大吸收波长为250nm士2nm。遇动植物中磷酸酯酶可分解而失去鲜味。44℃开始失去结晶水，120℃以上成无水物。易溶于水(13g/100ml，20℃)，水溶液呈中性，微溶于乙醇，几乎不溶于乙醚。
天然品存在于鲔鱼等中。 鲜味剂。如在酱油中加入5～10万分之一，即呈特殊鲜味。一般均与味精、鸟苷酸钠等合用，以提高增鲜效果。 肌苷酸钠液时国内外允许使用的呈味剂，较少单独应用，常与味精一起混合使用，混用时鲜味有相乘的作用。我国规定可用于各类饲料、食品添加剂，按生产需要适量使用。 肌苷酸钠也是国内外允许使用的呈味剂，单独应用较少，常与味精混合一起使用，混用时鲜味有相乘的作用。我国规定可用于各类食品，按生产需要适量使用。 主要用于各种原因引起的白细胞减少和急慢性肝病。 方法一、肌苷酸脱磷酸法
肌苷酸二钠的制备 棒状杆菌269发酵，发酵液去菌体，吸附，洗脱，浓缩，加乙醇，pH7-7.5条件下结晶可得肌苷酸二钠。
棒状杆菌269[发酵]→发酵液[去菌体，吸附，洗脱，浓缩]→浓缩液[乙醇]→[pH7-7.5]肌苷酸二钠
肌苷粗品的制备 在乙酸缓冲液中，调pH5.4-5.6，加压137-147kPa，脱磷酸5h，可得肌苷粗品。
肌苷酸二钠[乙酸，加压]→肌苷
精制 蒸馏水溶解，pH=6，重结晶，可得精品。
方法二、一步发酵法
菌株选育 变异芽孢杆菌7171-9-1移接到斜面培养基上，30-32℃培养48h。斜面培养基成分为葡萄糖1%，蛋白胨0.4%，酵母浸膏0.7%，牛肉浸膏1.4%，琼脂2%，在pH7、120℃灭菌20min。
变异芽孢杆菌7171-9-1[斜面培养]→[30-32℃, 48h]菌种斜面
种子培养
一级种子：培养基成分为葡萄糖2%，蛋白胨1%，酵母浸膏1%，玉米浆0.5%，尿素0.5%，氯化钠0.25%。灭菌前pH 7，用1L三角瓶装150ml培养基，115℃灭菌15min。每个三角瓶中接入白金耳环菌苔，在往复式摇床上，32℃±1℃培养18h。
二级种子：培养基同一级种子，放大50L发酵罐，定容体积25L，接种量 3%，32℃±1℃培养12-15h，搅拌速度320r/min，通风量1：0.25V/(V·min)，生长菌指标 A(650nm)=0.78，pH=6.4-6.6。
菌种斜面[摇床振荡]→[pH7, 32℃±1℃, 18h]一级种子培养液[50L发酵罐]→[pH6.4-6.6, 32℃±1℃, 12-15h]二级种子培养液
发酵 50L不锈钢标准发酵罐，定容体积35L。培养基成分为淀粉水解糖10%，干酵母水解液1.5%，豆饼水解液0.5%，尿素0.4%，硫酸镁0.1%，氯化钾0.2%，磷酸氢二钠0.5%，硫酸铵1.5%，有机硅油0.05%。pH=7，接种量0.9%，32℃±1℃培养93h，搅拌速度320r/min，通风量1：0.5V/(V·min)。500L发酵罐，定容体积350L。培养基成分为淀粉水解糖10%，干酵母水解液1.5%，豆饼水解液0.5%，硫酸铵1.5%，硫酸镁0.1%，氯化钾0.2%，磷酸氢二钠0.5%，碳酸钙1%，有机硅油小于0.3%。pH=7，接种量7%，32℃±1℃培养75h，搅拌速度230r/min，通风量1：0.25V/(V·min)。
20000L 发酵罐，培养基同上，接种量2.5%, 35℃±5℃培养83h。
二级种子培养液[50L发酵罐]→[pH7, 32℃±1℃, 93h]发酵液[500L发酵罐]→[pH7, 32℃±1℃, 75h]发酵液[20000L发酵罐]→[pH7, 35℃±1℃, 83h]发酵液
提取、吸附、洗脱 将发酵液30-40L 调pH=2.5-3，连同菌体通过2个串联的3.5kg 732H树脂柱吸附。用相当于树脂总体积3倍的pH 3水洗1次，把两柱分开，用pH 3水把肌苷洗脱下来，再经769活性炭柱吸附肌苷，先用2-3倍体积的水洗涤，再用70-80℃水洗，70-80℃，1mol/L氢氧化钠溶液浸泡30min，最后用0.01mol/L氢氧化钠溶液洗脱肌苷，收集洗脱液，真空浓缩，pH11或6放置，过滤，得粗品。
发酵液[732树脂柱]→[pH2.5-3]吸附物[水]→[pH2.5-3]洗脱液[769活性炭柱]→吸附物[蒸馏水，氢氧化钠]→[70-80℃][氢氧化钠]→[70-80℃]洗脱液[浓缩结晶]→[pH11或6]肌苷粗品
精制 将粗品配成5%-10%的溶液，加热溶解，抽滤，冷却，过滤，少量水洗，烘干，即得肌苷精制品。
肌苷粗品[蒸馏水]→[重结晶]肌苷成品。 核糖核酸(RNA)水解法
细胞中含有核糖核酸和脱氧核糖核酸(DNA)，而RNA水解可得4种核苷酸：腺苷酸、鸟苷酸、胞苷酸和尿苷酸，其中鸟苷酸和由腺苷酸转化而来的肌苷酸是呈味物质。核苷酸有2’-核苷酸、3’-核苷酸和5’-核苷酸，其中只有5’-核苷酸即5’-鸟苷酸和5’-肌苷酸具有呈味性能。
RNA的提取常以RNA含量较高的酵母(最为常用)和白地霉细胞(含RNA4～11%)为原料，采用稀碱液抽提。将酵母干细胞用水配成5%～10%的悬浮液，加入氢氧化钠使其质量分数达1%；在20℃下搅拌30～45min，再用6mol/L的盐酸中和至Ph=7.0；加热至900c时保温10min，以杀灭霉菌，再冷却至2~4℃静置2～3d；取上层清液用6mol/L的盐酸调Ph值至2.5(RNA等电点)，在2~4℃静置过夜；过滤得RNA，并用乙醇洗涤、干燥得RNA含量60%～70%的产品，产率4%～5%。酵母细胞也可在6%、8%的盐酸中浸提。
RNA水解 在30℃下将橘青霉菌ThoM的紫外线变异株N-10-14用麸皮培养5d，用90L的水抽提50kg的曲，得89L含有强力核酸酶P1(5’-磷酸二酯酶)的抽提液；将400mL酶液加入10L0.8%的RNA溶液中，调Ph值为5.6，并在65℃下反应2h，得混合核苷酸(腺苷酸0.22%、鸟苷酸0.19%、尿苷酸0.18%和胞苷酸0．14%)。
核苷酸的分离 利用各种核苷酸具有不同的等电点，用强碱性阴离子交换树脂来分离。将上述核苷酸混合液调Ph值至8，用国产717树脂上柱吸附，再依次用0.02mol/L甲酸、0.15mol/L甲酸、0.01mol/L甲酸-0.05mo1/L I甲酸钠和0.1 mol/L甲酸-0.1 mol/L甲酸钠洗脱，分别得到胞苷酸、腺苷酸、尿苷酸和鸟苷酸。
从腺苷酸制备肌苷酸钠 在30℃下用麸皮培养米曲霉48h，加10倍的水浸泡3h，得脱氨酶液；在腺苷酸液中加入10%的脱氨酶液，并在50～60℃和Ph=6下反应3h；加热至100℃以杀酶，过滤，取清液真空浓缩、结晶得产品肌苷酸二钠。
发酵法生产5L肌苷酸钠
生产中主要采用的发酵法为葡萄糖直接发酵法，或葡萄糖发酵生产肌苷，再磷酸化生成肌苷酸。
直接发酵法——一步法 以葡萄糖为碳源，异变株或产氨短杆菌为生产菌，直接发酵生产肌苷酸。
二步法 以60～70g/L的葡萄糖为碳源，以枯草芽孢杆菌为生产菌，在30～32℃、Ph=5～7下发酵80h生产肌苷；肌苷再与磷酸三乙酯反应生成肌苷酸。 1核糖核酸（RNA）水解法
细胞中含有核糖核酸和脱氧核糖核酸（DNA），而RNA水解可得4种核苷酸：腺苷酸、鸟苷酸、胞苷酸和尿苷酸。其中鸟苷酸和由腺苷酸转化而来得肌苷酸是呈味物质。核苷酸有2’-、3’-和5’-核苷酸，其中只有5’-核苷酸即5’-鸟苷酸和5’-肌苷酸具有呈味性能。（1）RNA的提取。常以RNA含量较高的酵母（最为常用）和白地霉细胞（含RNA4%-11%）为原料，采用稀碱液抽提。将酵母干细胞用水配成5%-10%的悬浮液，加入氢氧化钠使其质量分数达1%；在20℃下搅拌30-45min，再用6mol/L的盐酸中和至PH=7.0，加热至90℃时保温10min，以杀灭霉菌，再冷却至2-4℃静置2-3天；取上层清液用6mol/L的盐酸调PH至2.5(RNA等电点)，在2-4℃静置过夜；过滤得RNA，并容乙醇洗涤、干燥得RNA含量60-70%的产品，产率4%-5%酵母细胞也可在6%-8%的盐酸中浸提。
（2）RNA水解。在30℃下将橘青霉素ThoM的紫外线变异株N-10-14用麸皮培养5天，用90L的水提取50kg的曲，得89L含有强力核算酶P1（5’-磷酸二酯酶）的抽提液；将400mL酶液加入10L0.8%的RNA溶液中，调PH为5.6，并在65℃下反应2h，得混合核苷酸（腺苷酸0.22%、鸟苷酸0.19%和胞苷酸0.14%）。
（3）核苷酸的分离。利用各种核苷酸具有不同等电的性质，用强碱性阴离子交换树脂来分离。将上述核苷酸混合液调PH至8，用国产717树脂上柱吸附，再依次用0.02mol/L甲酸、0.15mol/L甲酸、0.01mol/L甲酸+和0.1mol/L甲酸+0.1mol/L甲酸钠洗脱，分别得到胞苷酸、腺苷酸、尿苷酸和鸟苷酸。
(4)从腺苷酸制备肌苷酸钠。在30℃下用麸皮培养米曲霉48h，加10倍水浸泡3h，得脱氨酶液；在腺苷酸液中加入10%的脱氨酶液，并在50-60℃和PH=6下反应3h；加热至100℃以杀酶，过滤，取清液真空浓缩、结晶得产品肌苷酸二钠。
2 发酵法生产5’-肌苷酸钠
生产中采用的发酵法主要为葡萄糖直接发酵法，或葡萄糖家教生产肌苷，再磷酸化生成肌苷酸。
（1）直接生产发酵—— 一步法。以葡萄糖为碳源，异变株或产氨短杆菌为生产菌，直接发酵生产肌苷酸。
（2）二步法。以60-70g/L的葡萄糖为碳源，以枯草芽孢杆菌为生产菌，在30-32℃、PH=5-7下发酵80h生产肌苷；肌苷再与磷酸三乙酯反应生成肌苷酸。 由酵母所得核酸分解、分离而得。
淀粉糖化液(葡萄糖)经直接发酵法制得肌苷酸，作选择性羟基磷酸化，再精制中和成钠盐后结晶而得。