核酸酶 P1

核酸酶P1(Nuclease P1，EC3．1．30．1)，又名5'-磷酸二酯酶，是一种含锌的金属酶，核酸酶P1能够水解RNA和热变性DNA得到5'-核苷酸，广泛运用于核苷酸工业生产中，是具有重要应用价值的酶制剂。核苷酸是生物体内重要的低分子化合物，具有许多生理功能，目前，随着在婴幼儿奶粉及保健品领域的广泛应用，核苷酸市场变得越来越大。核酸酶P1在核苷酸工业化生产中起着至关重要的作用。

核酸酶P1的分子量约为44KD，由331个氨基酸多肽单链构成，含有2个二硫键，并含有3个锌原子，酶分子含17.4%的碳水化合物。核酸酶P1的活性中心存在的一个三锌结构，Zn1~Zn3大约相距0.32 nm，Zn2~Zn1相距0.58 nm，Zn2~Zn3相距0.47 nm；两个水分子(W2和W3)吸附在Zn2上，一个水分子(W1)搭桥于Zn1和Zn3之间。研究认为W2在催化过程中可能起亲核试剂的作用。C. Romier等人利用底物结构类似物结合核酸酶，获得高分辨率的核酸酶x-射线晶体(0.18 nm)。其结构分析表明，核酸酶P1有两个口袋样的结构，可能是两个对单核苷酸的吸附或识别位点。其中一个位点（Phe位点）靠近三锌活性中心，主要是依靠Phe61和腺苷酸之间的相互作用。在这个吸附位点底部,Asp63的羧基可能与腺苷酸的N1以及6-NH2形成氢键。第二个识别位点为Tyr位点，在这个位点中，腺苷酸象三明治一样被夹在Tyr144和Tyr155之间，位点底部的Asp146和腺苷酸可能形成氢键。三锌活性中心处于其中一种口袋模样结构的附近，由于该结构只允许单链的RNA或DNA进入，所以核酸酶P1只能催化单链的核酸。研究还表明，每个识别结构底部的Asp与腺苷酸形成的氢键可能与核酸酶P1的最适pH值有关，即pH值的大小直接与氢键形成的多少以及牢固程度有关系。根据分子结构推测核酸酶P1的催化机理可能为：在Zn1和Zn3之间水分子的-OH经过Asp45激活后攻击单链核酸的P-O3′键，从而与O3R′发生亲核取代，Zn2对劈分下来的O3′起到稳定作用，多余的负电荷则被Arg48中和。 核酸酶P1是一种含锌的金属酶，能够水解RNA和热变性DNA得到5'-核苷酸，广泛运用于核苷酸工业生产中，是具有重要应用价值的酶制剂。 核酸酶P1是一种磷酸二酯酶，只切割单链DNA或RNA,而对碱基对没有特异性。实际上，该酶具有两种酶的活性，一是磷酸二酯酶活性，作用于RNA或DNA单链中的3', 5'--磷酸二酯键，生成5'-核苷酸；二是3'-磷酸单酯酶活性，分解单核苷酸或寡聚核苷酸中的3′-磷酸单酯键。但是也有报道低浓度核酸酶对某些核苷酸序列有一定的嗜好性。影响核酸酶P1催化活性的因素很多，主要有温度、pH值、金属离子和一些有机试剂。

核酸酶P1的生产方法主要有3种：固体发酵法、深层液态发酵法以及固定化液体发酵法。固体发酵(solid-state fermentation,SSF)操作简单，成本低，利用麸皮等农作物为原料，也能够得到较高酶活的粗酶液。但是由于这些农产品成分非常复杂，因而，要想获得纯的核酸酶P1较为困难和繁琐。

深层液态发酵法利用现代发酵技术，通过装在发酵罐中的各种感应器，可以较好的控制发酵过程，其原料的配比也比较明确。通常的液体发酵主要工艺条件为:合成液体培养基，通风1∶0.4,发酵温度30℃，培养时间为50~70 h。不同生产厂家的工艺条件依据本身使用的菌种和设备有所调整。总体来说，液态发酵的菌丝体和发酵液较易分离，是目前国内外生产核酸酶P1粗酶液的主要方法，广泛运用于核苷酸发酵中。