2-去氧氟尿苷的制备方法

背景及概述^[1]

天然核苷是由核糖或脱氧核糖与天然碱基所形成，由于天然碱基的多样性，构成的核糖核苷或脱氧核糖核苷也是种类繁多。天然核苷中的碱基或糖基经过化学修饰形成新的核苷，这种经过人工合成的核苷即为核苷类似物。核苷类似物与核苷酸在化学结构上具有类似性，可以假乱真混入DNA合成的过程中，但因其不具备核苷酸的功能，所以导致合成的核酸链失去了正常的功能。通过氮杂、脱氮、取代等化学修饰方法，对正常碱基的嘧啶和嘌呤进行修饰就可得到核苷类药物。核苷类似物在病毒或肿瘤细胞的遗传物质表达的过程中，被整合到DNA链中，不仅大大降低了聚合酶的活性，也终止了DNA的合成，从而使病毒细胞无法增殖传代，导致病毒的灭亡。因此，核苷类药物在治疗艾滋病毒、乙肝病毒、肿瘤等领域表现出极大的优势。据统计，在目前使用的抗病毒药物中有将近50％是核苷类药物。

核苷类药物中的5-氟尿苷是一种重要的5-氟嘧啶类衍生物，可以制备多种抗癌抗病毒药物，特别是可以做为抗肿瘤新药氟铁龙(DFUR)的前体。2-去氧氟尿苷为脲嘧啶类抗代谢物，属细胞周期特异性抗肿瘤药，可抑制胸腺嘧啶脱氧核苷酸合成酶，阻断脲嘧啶脱氧核苷酸转变成胸腺嘧啶核苷酸，从而影响DNA的合成，起到抗病毒和抗肿瘤的作用。该药对多种肿瘤细胞具有显著的抑制作用，临床上主要用于治疗肝癌、胃肠系癌、乳腺癌和头颈部肿瘤等，与常用抗肿瘤药物5-氟脲嘧啶(5-fluorouracil)相比，具有低细胞毒性和易于在体内被吸收的优点。现有技术中，常采用化学法糖基化得到脱氧氟尿苷，产物中会出现多种同分异构体，并且合成步骤繁多，需要对碱基或核糖基上的活性基团进行修饰保护，且合成过程中大量使用有机溶剂，同时还要使用毒性较大的氟化物、溴化物、重金属等，对环境造成巨大的污染。核苷磷酸化酶可以催化核苷或脱氧核苷的糖苷键的可逆磷酸化反应，提供核糖-1-磷酸，并释放碱基，加入其它碱基可形成另一种新的核苷。因此，核苷磷酸化酶主要用作酶法合成核苷类似物的工具。但是，现有核苷磷酸化酶的转化率较低，制备核苷类药物的成本较高。。

制备^[1]

2-去氧氟尿苷的制备如下：以核苷磷酸化酶PyNP为催化剂，采用不同的核糖供体和碱基受体，制备5-甲基尿苷、5-氟尿苷、5-氮胞苷、5-氟胞苷、胸苷、2-去氧氟尿苷、2’-脱氧-5-氮胞苷、2’-脱氧-5-氟胞苷、2’-脱氧-5-氟尿苷、2’-脱氧-5-氟胞苷、2’-脱氧-5-氟胞苷、2’-脱氧-5-甲基尿苷、阿糖-5-氟尿苷、阿糖-5-氮胞苷和阿糖-5-氟胞苷。在1ml的pH8.0、80mM的磷酸缓冲液中(含有1mM的EDTA)，分别加入终浓度为60mM的核糖供体和终浓度为30mM的碱基受体，加入终浓度为1.5U/mL纯化后的核苷磷酸化酶，在50℃、转速为900rpm的恒温振荡反应器中反应。反应3h后，取50μl样品加入到950μl甲醇中以终止反应，利用高效液相色谱HPLC检测产物。检测条件：利用AgilentTC-C18的检测柱，流动相为甲醇：水＝95：5，检测波长为254nm，柱温为30℃，流速为1ml/min。根据峰面积计算底物的转化率。其中核糖供体为尿苷、2’-脱氧尿苷、胸苷、2’，3’-双脱氧胸苷或阿糖尿苷。碱基受体为5-甲基脲嘧啶、胸腺嘧啶、5-氟脲嘧啶、5-氮胞嘧啶或5-氟胞嘧啶。

主要参考资料

[1] CN201610218675.2一种核苷磷酸化酶、编码基因及其高产菌株和应用