核糖核酸酶A的提取方法

背景及概述^[1]

核糖核酸酶A是一类水解RNA的酶，广泛存在于所有动植物和微生物中，按其作用位点和磷酸酯键断裂的方式可分为生成3′-磷酸基团的内切核糖核酸酶(膜核糖核酸酶、核糖核酸酶T1和生成5′-磷酸基团的内切核酸酶(RNase H)、外切核糖核酸酶(大肠杆菌RNaseⅡ、大肠杆菌的寡核苷酸RNase、RNA的肿瘤病毒的RNase H)。核糖核酸酶，核糖核酸酶T1是实验室中除去样品中的RNA或RNA顺序测定中常用的酶。胰核糖核酸酶(RNase A)是从牛胰中提取的RNase，是高度专一的内切核酸酶，专一水解RNA链中的嘧啶核苷酸键，生成3′-嘧啶核苷酸或3′末端为嘧啶核苷酸的寡核苷酸，核糖核酸酶T1是从米曲霉菌中制备的一种高度专一性的内切核酸酶，专一水解RNA产生3′鸟苷酸和3′端为鸟苷酸的寡核酸。核糖核酸酶H(RNase H)常用于反转录合成中，只作用于DNA-RNA双链中的RNA。

提取方法^[2]

一种核糖核酸酶A的提取方法，分离提纯具有酶活性的、高纯度的S核糖核酸酶，可用于分离提纯其它蔷薇科果树(如苹果、杏、梅、樱桃等)雌       蕊S基因的S核糖核酸酶和其它植物组织特异性蛋白质。本发明所提供的一种核糖核酸酶提取方法，包含下列步骤：

1)植物样品的采集：采集开花前的大花蕾，从花蕾分解出花柱，经称重后装入塑 料瓶内，保存于液氮中待用；

2)抽提液的制备(配方)：以MES/NaOH缓冲液(pH＝6.5)为制备抽提液的溶液， 按溶液体积比添加3％的polyclar-AT、1.5％抗坏血酸钠和5mmol·L^-1的EDTA·Na2， 得到核糖核酸酶抽提液A；

3)抽提过程：

在1～4℃低温条件下，取花柱样品，加入上述核糖核酸酶抽提液A进行提取后，离心，上清液为花柱可溶性蛋白质溶液，经过孔经0.45μm的过滤网过滤后，以流速 0.5～1ml/min的速率通过CM琼脂糖凝胶(CM sepharose)阳离子交换层析柱之后，用 100～200ml的20mmol·L^-1 MES/NaOH缓冲液清洗上述CM层析柱，而后用100～200ml 的350mmol·L^-1NaCl溶液将核糖核酸酶从CM层析柱中洗脱下来，获得核糖核酸酶 溶液B；

按体积比添加4倍液的20mmol·L^-1MES/NaOH缓冲液稀释，同样经孔径0.45μm 的过滤网过滤后，将其以流速0.5～1ml/min的速率通过SP琼脂糖凝胶(SP sepharose) 阳离子交换层析柱；用100～200ml的180mmol·L^-1NaCl溶液以相同的流速来清洗上述SP层析柱；再用100～200ml的250～320mmol·L^-1的NaCl溶液将吸附于SP层析柱内的核糖核酸酶全部溶出，回收得到核糖核酸酶溶液C；

核糖核酸酶溶液C用按溶液体积计算100％饱和的硫酸铵沉析后离心，获得核糖 核酸酶。

相关研究^[3-4]

王立霞等人为了了解核糖核酸酶ARnaseⅢrncS基因缺失对单核细胞增生李斯特菌(LM)环境应激和生物被膜形成的影响，以LMSB5强毒株为对象，利用温度敏感型穿梭质粒pKSV7，通过基因重叠延伸PCR(SOE-PCR)和同源重组技术构建LM-ΔrncS基因缺失突变株，检测其在不同温度、pH、高盐、乙醇、H₂O₂胁迫环境下的适应能力，通过结晶紫染色法检测生物被膜的形成能力。

结果：与LM-SB5株相比，构建的LM-ΔrncS在37℃、pH 4及pH 7的环境适应能力无显著变化(P>0.05)，而在30℃、42℃、pH 9、5%NaCl、3.8%乙醇、0.1%H₂O₂的应激环境下其适应能力及生物被膜的形成能力显著降低(P<0.05)，提示RnaseⅢRncS参与了LM对低温、高温、碱、高盐、乙醇及H₂O₂胁迫环境的适应过程及生物被膜形成的调控。结论：构建的LM-ΔrncS基因缺失突变株，在不同应激环境下的适应能力及生物被膜形成能力均显著降低，为RnaseⅢRncS参与LM ncRNA调控环境应激的分子机制研究奠定了基础。      

杨科成等人利用分子动力学模拟研究了在不同尿素浓度下，核糖核酸酶Sa(RNase Sa)表面水和尿素分子的分布和动力学行为。结果表明，尿素分子可与RNase Sa酶形成较强的相互作用，并取代其表面的水分子而富集在蛋白质表面。尿素分子更倾向与RNase Sa酶的疏水残基作用，与RNase Sa酶主链形成氢键的能力更强。尿素分子的平动和转动远远慢于水分子的平动和转动。RNase Sa酶表面水分子的平动和转动随着尿素浓度增加而逐渐变慢，但RNase Sa酶表面尿素分子的动力学并不依赖于尿素浓度变化。本研究中明晰的RNase Sa酶表面水和尿素分子分布和动力学有助于理解水和尿素分子对蛋白质稳定性的影响。

主要参考资料

[1] 卫生学大辞典

[2] CN02137955.6 一种核糖核酸酶A的提取方法

 [3] 王立霞，孟庆玲，乔军，蔡扩军，王登峰，伍晔晖，王熙凤，郭晶，才学鹏.核糖核酸酶ARnaseⅢ rncS基因缺失对单核细胞增生李斯特菌环境应激的调控作用研究[J].中国病原生物学杂志，2018，13(10):1078-1083.

[4]杨科成，崔凤超，李云琦.核糖核酸酶Sa表面水和尿素分子的分布和动力学行为的分子动力学模拟[J].应用化学，2018，35(10):1243-1248.