核糖核酸酶A的纯化生产工艺

背景技术

核糖核酸酶A(RNaseA)是内切核糖核酸酶，可特异地攻击RNA上嘧啶残基的3'端，切割与相邻核苷酸形成的磷酸二酯键。核糖核酸酶A是脊椎动物所特有的蛋白质家族，除了水解RNA以外，它们还参与细胞成熟、细胞凋亡、血管生成以及宿主防御等过程，在疾病的诊断和治疗方面表现出重要的应用价值。

RNaseA家族成员具有很高的序列相似性，它们大多含有6-8个半胱氨酸并形成分子内二硫键，以维持特有的空间结构。RNaseA基因结构中不含有内含子，成熟的RNaseA的氨基酸序列中均含有非常保守的CKXXNTF氨基酸序列(XX为任意氨基酸）。

核糖核酸酶A最早是在牛的胰腺中发现的，牛胰腺核糖核酸酶A包括一个374bp的开放阅读框，编码124个氨基酸的多肽链(如SEQIDN0:4所示），预测其等电点为8.30,分子量为14kD。

牛胰腺核糖核酸酶A是个被应用于动物肿瘤和白血病临床治疗的RNaseA，并取得一定的效果。目前所用的RNaseA多从牛胰腺中提取，虽然原料来源丰富，但纯化的技术要求较高，而且有DNA酶和病毒(如牛海绵状脑病病毒)污染危险，因此，WHO和FDA等国际权威机构明确规定动物源性的牛核糖核酸酶A不能用于制备人和动物基因治疗或基因免疫用途的重组质粒。

张泉等发表的论文"牛胰腺核糖核酸酶A的基因克隆、表达及初步鉴定"中提出利用RT-PCR从牛胰腺总RNA中扩增出大小和序列正确的RNaseAcDNA，并在大肠杆菌中获得分泌性表达重组酶，为生物制品级核算疫苗或基因治疗用途质粒DNA的制备提供了借鉴。但是，使用该方法诱导表达的重组核糖核酸酶A蛋白表达量不高，且纯化困难。

纯化生产工艺

以下结合实施例对本发明作进一步具体描述。应该指出，以下具体说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有说明，本发明使用的所有科学和技术术语具有与本发明所属技术领域人员通常理解的相同含义。

含有新型核糖核酸酶A基因的重组质粒的构建

对SEQIDN0:2所示的基因序列进行重组质粒的构建。该基因编码的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示，我们将其称之为新型核糖核酸酶A。新型核糖核酸酶A与现有的牛胰腺核糖核酸酶A氨基酸序列（SEQIDN0:4所示，其碱基序列如SEQIDN0:3所示）相比，其突变位点为第38位、第88位、第109位、第120位，分别由D突变为R、由G突变为D、由A突变为R、由F突变为G。新型核糖核酸酶A由124个氨基酸残疾组成，属碱性蛋白质，其具有核糖核酸酶A家族的典型结构，如由8个半胱氨酸形成的四个分子内二硫键和CKXXNTF特征结构，属于核糖核酸酶A家族。

含有新型核糖核酸酶A基因的重组质粒的构建，包括以下步骤：

S1:对SEQIDN0:2所示的基因序列进行全基因合成（由华大基因合成），得到新型核糖核酸酶A基因。

S2:将新型核糖核酸酶A基因连接到PPIC9K载体(购自invitrogen)上，构建PPIC9K重组质粒。

S3:将重组质粒从大肠杆菌中提取出来，将PPIC9K重组质粒线性化，然后电转化到毕赤酵母GS115(购自invitrogen)中。

质粒DNA线性化(5X0.5mLEP管中酶切体系）：

混合，稍离心，37°C，酶切150min左右，电泳检测质粒酶切程度，以未酶切质粒作为参照，线性化后质粒位于未酶切质粒上方。

酵母电转化法感受态细胞制备：

1)在含5mlYPD的50ml离心管中，培养毕赤酵母，30度过夜，取0.1-0.5ml过夜培养物，接种含l〇〇ml新鲜培养基的500mL摇瓶，过夜生长至0D600=1.3-1.5(早7点挑单菌落至5mlYro培养基中，260rpm摇菌，晚10点转接至500ml摇瓶中，250rpm摇菌，次日下午可做感受态)；

2)在4度，1500g离心5min收集细胞，用100ml预冷的灭菌水悬浮细胞；

3)如上离心，用50ml预冷的灭菌水悬浮细胞；

4)如上离心，用4ml预冷的1M山梨醇悬浮细胞至4X1.5mL离心管中；

5)如上离心，用200ul预冷的1M山梨醇悬浮细胞，至终体积约400ul。

转化:采用电转杯，去离子水洗净，紫外灯照射过夜：

1)取80ul上述细胞与5-20ug线性化DNA(溶于5-10ulTE)混合，转入预冷的0.2cm电转杯中；

2)在冰上放置5min;

3)根据所使用装置推荐的酿酒酵母参数进行电击，参数：1500¥、400〇、251^、5msec；

4)立即加入1ml预冷的1M山梨醇至杯中，将内容物转移至灭菌离心管中；

5)分成200-600ul等份，涂于MD或RDB平板上；

6)在30度孵育平板至克隆产生，按P41筛选Mut+/Muts表型。

S4:筛选重组子，获得毕赤酵母重组质粒。

筛选:分别配制四个G418浓度梯度（1mg/mL、2mg/mL、4mg/mL、6mg/mL)的YH)筛选平板(酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，1.5%琼脂）。进行培养的MD平板，用无菌牙签各挑取70个酵母单菌落，点在上述四个G418浓度梯度的YPD筛选平板中，并作相应编号。每个克隆均做4个梯度的筛选。