IPTG的诱导原理

IPTG的诱导原理

【IPTG对外源蛋白诱导表达的原理】
原核生物绝大多数的基因按功能相关性成簇地排列，且密集于染色体上，共同形成一个转录单位——操纵子（元），也称基因表达的协同单位(a coordinated unit of gene expression)。E.coli的乳糖操纵子（元）含Z、Y及A三个结构基因，分别编码β-半乳糖苷酶（β-galactosidase）、通透酶（permease）和乙酰基转移酶（transacetylase)；此外还有调控基因：操纵序列O（operator）、启动序列P（promoter）；而I(编码Lac阻遏物，Lac repressor)不属于乳糖操纵子。

图1为IPTG诱导表达原理图

Lac阻遏物是一种具有4个相同亚基的四级结构蛋白，都有一个与诱导剂结合的位点。在没有乳糖存在时，lac操纵子（元）处于阻遏状态，Lac阻遏物能与操纵基因O结合，阻碍RNA聚合酶与P序列结合，抑制转录起动。而当有诱导剂与阻遏蛋白结合后，其蛋白构象就发生变化，导致阻遏物从操纵基因O上解离下来，RNA聚合酶不再受阻碍，发生转录。
在这个操纵子（元）体系中，真正的诱导剂并非乳糖本身。乳糖进入细胞，经β-半乳糖苷酶催化，转变为半乳糖——即生理上的诱导剂。而在实验中，通常选用异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）作为诱导剂，IPTG是一种作用极强的诱导剂，不被细菌代谢而十分稳定，因此被实验室广泛应用。

【IPTG对外源蛋白诱导表达的实验步骤】
1.实验方法
材料：
（1）诱导表达材料：LB（Luria—Bertani）培养基：酵母膏(Yeast extract)5g、蛋白胨(Peptone) 10g、NaCl 10g、琼脂(Agar) 1-2%、蒸馏水(Distilled water) 1000ml pH 7.0、
IPTG 贮备液：2g IPTG溶于10mL蒸馏水中，0.22μm滤膜过滤除菌，分装成1mL/份，-20 ℃保存；
凝胶电泳加样缓冲液：50mmol/L Tris-CI( pH 6.8)、50mmol/LDTT、2% SDS（电泳级）、0.1％ 溴酚蓝、10％ 甘油
（2）大肠杆菌包涵体的分离与蛋白纯化材料：
     1)酶溶法
裂解缓冲液：50 mmol/L Tris-CI(pH 8.0)、1 mmol/L EDTA、100 mmol/L NaCI；50 mmol/L 苯甲基磺酰氟(PMSF)；10 mg/mL溶菌酶；脱氧胆酸；1 mg/mL DNaseI.
     2)超声破碎法
TE 缓冲液.
2×SDS-PAGE 凝胶电泳加样缓冲液：100 mmol/L Tris-HCI (pH 8.0)、100 mmol/L DTT、4 %SDS、0.2 % 溴酚蓝、20 % 甘油。
2.实验方案
（1）外源基因的诱导表达：
     1) 用适当的限制性内切核酸酶消化载体DNA和目的基因；
     2) 按连接步骤连接目的基因和载体，并转化到转化DH5α感受态细胞中；
     3) 分别挑取单菌落接种于5mL LB ( 0.1g·L-1 氨苄青霉素)中，37℃培养过夜；
     4) 以2%体积比转接于2ml LB( 0.1 g·L-1 氨苄青霉素)中，37℃继续培养2.5 hr，至细菌对数生长期，加0.1mmol/L IPTG 2μl诱导3-4hr，同时设立不加IPTG诱导作为对照； 
     5) 取上述菌液1mL，12000rpm离心10min，收菌沉淀；
     6) 重悬于冰的100μl PBS中，加入PMSF至终浓度为10 mmol/L。震荡器震荡混匀，加入2×加样缓冲液，煮沸10min变性，12,000rpm离心10min；
     7) 分别取诱导前和诱导后的样品10 μl进行SDS-PAGE电泳分析。
（2）大肠杆菌包涵体的分离与蛋白质纯化：
     细菌的裂解
     常用方法有：① 高温珠磨法;② 高压匀浆;③ 超声破碎法;④ 酶溶法;⑤ 化学渗透等.前三种方法属机械破碎法,并且方法① 、② 已在工业生产中得到应用,后三种方法在实验室研究中应用较为广泛.下面介绍酶溶法和超声破碎法的实验步骤.
     酶溶法.常用的溶解酶有溶菌酶;β-1,3 -葡聚糖酶;β-1,6 -葡聚糖酶;蛋白酶;壳多糖酶;糖昔酶等.溶菌酶主要对细菌类有作用,而其他几种酶对酵母作用显著.主要步骤为：
     4 ℃ ,5000rpm 离心,15 min ,收集诱导表达的细菌培养液(100 mL ).弃上清,约每克湿菌加3 mL 裂解缓冲液,悬浮沉淀.

【IPTG诱导大肠杆菌表达目标蛋白的作用原理】
用乳糖操纵子作为启动子进行蛋白质表达的时候,需要诱导物进行诱导(相当于点火),但乳糖可以被细胞利用掉,所以利用IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)在结构上与乳糖的相似性也可以将基因表达启动,但它不能被细胞利用掉,从而实现持续的表达.

【主要参考资料】
[1]http://www.biodiscover.com/news/research/121770.html.
[2]http://www.doc88.com/p-0468747498683.html.
[3]http://www.bio1000.com/experiment/protein/378113.html.
[4]http://wenda.so.com/q/1378486341071301.