NOX4抗体的应用

背景^[1-3]

NOX4抗体是一种可以特异性结合NOX4的人工合成抗体，可以靶向结合人、小鼠、大鼠和猪样品中的NOX4蛋白。NOX4抗体可用于多种科学应用，包括Western Blot、免疫组织化学、免疫细胞化学、免疫沉淀和ELISA。

Nox4抗体（C-3）是一种小鼠单克隆IgG2b kappa轻链抗体，专门用于检测人类Nox4蛋白，也称为Renox，是NADPH氧化酶家族的重要组成部分。Nox4通过产生活性氧（尤其是超氧阴离子）在细胞氧化还原信号传导中发挥重要作用，而活性氧对于调节细胞分化、增殖和缺氧反应等过程至关重要。翻译后修饰（如磷酸化）可调节Nox4的活性，并促进其与p47-phox和p67-phox等蛋白的相互作用，这些蛋白对于组装活性NADPH氧化酶复合物是必不可少的。此外，Nox4还与TGF-β等通路中的关键信号蛋白相互作用，从而凸显其在纤维化和血管重塑等过程中的作用。

将抗Nox4抗体（C-3）用于蛋白质印迹（WB）、免疫沉淀（IP）、免疫荧光（IF）和酶联免疫吸附测定（ELISA），这些应用中均能证明其与人类Nox4的反应性。Nox4在肾皮质近曲小管上皮细胞中大量表达，Nox4有助于促红细胞生成素的产生，此外在胎儿组织、胎盘、胶质母细胞瘤细胞和血管细胞中也有发现。在血管细胞中，Nox4表达会因血管紧张素II而上调，这强调了Nox4在血管氧化应激反应中的重要性及其对心血管疾病的潜在影响。Nox4(C-3)抗体适用于研究Nox4在各种生物学环境中的不同功能和调节机制的研究人员。

NOX4抗体

NOX4抗体使用步骤（Western Blot）：

1.样本制备

1）融解RIPA裂解液（RIPA裂解液-细胞/组织裂解液缓冲液），混匀。

2）贴壁细胞：去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。

3）充分裂解后，10000-14000g离心3-5min，取上清，即可进行后续的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。

2.蛋白电泳

1）取出预制胶，将预制胶固定在电泳槽中，内槽加满tris-glycine电泳缓冲液。

2）在室温或不超过37℃的水浴中溶解5XSDS-PAGE上样缓冲液。水浴溶解后立即室温存放。

3）混合蛋白样品和5XSDS-PAGE蛋白上样缓冲液。

4）100℃或沸水浴加热3-5min，以充分变性蛋白，之后冷却至室温备用。

5）上样蛋白，并在1个孔中上样蛋白marker，盖上电泳槽盖，打开电源，电泳至蓝色染料到达胶的底端处附近即可停止电泳。

6）电泳后取出胶板，用刀在侧边硅胶处，沿着两片玻璃缝隙切开硅胶，即可打开玻璃板；取胶时。

3.转膜与封闭

1）将胶浸于预冷的转膜缓冲液中平衡5min。

2）依据胶的大小剪取膜和滤纸6片，放入预冷的转膜缓冲液中平衡10min，如用PVDF膜，需参照说明书，先用纯甲醇浸泡1-2min，再孵育于预冷的转膜缓冲液中。

3）装配转移三明治：海绵/3层滤纸/胶/膜/3层滤纸/海绵，每层放好后，用试管赶尽气泡。

4）将转移槽置于冰浴中，放入三明治，膜靠近阳极，胶靠近阴极，加入转移缓冲液，插上电极，100V，1h（电流约为0.3A）。

5）转膜结束后，切断电源，取出膜。

6）将膜浸没在5mL丽春红染色液中，置于轨道摇床上室温染色5~10min或更长，直待膜上显示出蛋白条带。

7）清洗：取出膜，用蒸馏水，PBS或者其他适当溶液冲洗至背景清晰后拍照，大概冲洗2~3次，每次5min。

8）脱色：将膜放到0.1N NaOH溶液漂洗5min；倒去洗脱液，再重复一次。

9）清洗：再用蒸馏水清洗膜2~3次，每次5min。

10）将膜置于25mL封闭缓冲液中，在室温下孵育1小时。

11）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。

4.抗体孵育与检测

1）将膜和一抗（NOX4抗体按照产品应用推荐稀释度）置于10mL一抗稀释缓冲液中在4℃下孵育过夜并不时轻轻晃动。

2）用5mL TBST洗涤三次，每次15min以去除残留的一抗(NOX4抗体)。

3）将膜和二抗（按照产品应用推荐稀释度）置于10mL封闭缓冲液中孵育1-2小时并不时轻轻晃动。

4）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。

5）最后一次洗膜的同时，按照ECL超敏试剂盒说明书，新鲜配制发光工作液。

6）用平头镊取出膜，搭在滤纸上沥干洗液。将膜完全浸入发光工作液中，与发光工作液充分接触。室温孵育3min，准备立即压片曝光。但勿洗去发光液。

7）显影曝光。

应用^[4][5]

NOX4抗体可以用于剪接调控蛋白ESRP1和NOX4对气道上皮间质转化的作用的研究

探讨ESRP和NOX4对慢性阻塞性肺疾病上皮间质转分化(EMT)的影响,以及它们如何调节上皮剪切过程。

研究方法:1、建立COPD烟熏小鼠模型,探索ESRP1、NOX4与小鼠气道上皮细胞间质转分化的关系:在广州医科大学EC的审核下,我们从C57BL/6J周龄的((8-10周龄、18-20g/只)共48只,随机分为对照组(空气暴漏组)和CS组(烟雾暴漏组),造模时间12周及24周后麻醉状态下处死;分别于造模12周及24周后均行肺功能检测评估COPD造模效果,留取外周血及肺泡灌洗液通过ELISA实验、吉姆萨染色等检测氧化应激指标及炎性指标,留取肺组织通过免疫组织化学染色、蛋白免疫印迹等检测ESRP1、NOX4及ECM标志物。2、体外BEAS-2B细胞研究ESRP1、NOX4在上皮细胞转分化中的作用及可能的信号机制:培养气道上皮细胞系(BEAS-2B),分别用CSE、TGFβ1干预细胞后,使用NOX4抗体免疫印迹、免疫细胞化学、免疫荧光定量检测ESRP1、NOX4及ECM标志物,流式细胞术来检测细胞内ROS的水平。通过ELISA技术,我们可以测量培养基上清中MDA和SOD3的表达水平,并使用NOX4抑制剂GKT138731对BEAS-2B细胞进行预处理,然后再使用TGFβ1继续作用,以NOX4抗体蛋白免疫印迹技术来检测ESRP1和ECM标志物的表达,以确保细胞的健康。此外,我们还可以使用NAC技术,在细胞之间进行预处理,然后再使用TGFβ1继续作用,以确保细胞的健康。通过蛋白免疫印迹技术,我们可以确定NOX4、ESRP1和ECM标志物的表达水平是否一致。

参考文献

[1]Chronic obstructive pulmonary disease.[J].Christenson Stephanie A;Smith Benjamin M;Bafadhel Mona;Putcha Nirupama.Lancet(London,England).2022

[2]Global,regional,and national prevalence of,and risk factors for,chronic obstructive pulmonary disease(COPD)in 2019:a systematic review and modelling analysis.[J].Adeloye Davies;Song Peige;Zhu Yajie;Campbell Harry;Sheikh Aziz;Rudan Igor.The Lancet.Respiratory medicine.2022

[3]FERMT3 mediates cigarette smoke-induced epithelial–mesenchymal transition through Wnt/β-catenin signaling[J].Su Xiaoshan;Chen Junjie;Lin Xiaoping;Chen Xiaoyang;Zhu Zhixing;Wu Weijing;Lin Hai;Wang Jianming;Ye Xiangjia;Zeng Yiming.Respiratory Research.2021

[4]Disease burden of COPD in China:a systematic review.[J].Zhu Bifan;;Wang Yanfang;;Ming Jian;;Chen Wen;;Zhang Luying.International journal of chronic obstructive pulmonary disease.2018

[5]王佳琪.剪接调控蛋白ESRP1和NOX4对气道上皮间质转化的作用的研究[D].宁夏医科大学,2023.