RAB11A抗体的应用

背景^[1-3]

RAB11A抗体是一种可以特异性结合RAB11A的人工合成抗体，可以靶向结合人、小鼠、大鼠和猪样品中的RAB11A蛋白。RAB11A抗体可用于多种科学应用，包括Western Blot、免疫组织化学、免疫细胞化学、免疫沉淀和ELISA。

Rab 11A抗体（A-6）既可以是非偶联的抗Rab 11A抗体形式，也可以是多种偶联形式的抗Rab 11A抗体，包括琼脂糖、HRP、PE、FITC和多种Alexa Fluor®偶联物。Ras相关的鸟苷酸结合蛋白超家族，包括Ral/Rec、Rap、R-Ras和Rho/Rab亚家族，与Ras p21具有30-60%的同源性。积累的数据表明，Rab蛋白在内吞作用或生物合成蛋白转运中起着重要作用。新合成的蛋白从内质网转运到高尔基复合体的各个部位以及分泌囊泡，每个阶段都涉及载体囊泡的移动，这一过程似乎与Rab蛋白的功能有关。Rab蛋白也可能直接指导从分泌囊泡到质膜的胞吐作用，这一可能性得到了以下观察的支持：在酵母中，与Rab蛋白具有40%同源性的SEC4蛋白与分泌囊泡相关。已经鉴定出Rab亚家族的几个成员，每个成员都存在于膜转运途径的特定阶段。

RAB11A抗体

RAB11A抗体使用步骤（Western Blot）：

1.样本制备

1）融解RIPA裂解液（RIPA裂解液-细胞/组织裂解液缓冲液），混匀。

2）贴壁细胞：去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。

3）充分裂解后，10000-14000g离心3-5min，取上清，即可进行后续的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。

2.蛋白电泳

1）取出预制胶，将预制胶固定在电泳槽中，内槽加满tris-glycine电泳缓冲液。

2）在室温或不超过37℃的水浴中溶解5XSDS-PAGE上样缓冲液。水浴溶解后立即室温存放。

3）混合蛋白样品和5XSDS-PAGE蛋白上样缓冲液。

4）100℃或沸水浴加热3-5min，以充分变性蛋白，之后冷却至室温备用。

5）上样蛋白，并在1个孔中上样蛋白marker，盖上电泳槽盖，打开电源，电泳至蓝色染料到达胶的底端处附近即可停止电泳。

6）电泳后取出胶板，用刀在侧边硅胶处，沿着两片玻璃缝隙切开硅胶，即可打开玻璃板；取胶时。

3.转膜与封闭

1）将胶浸于预冷的转膜缓冲液中平衡5min。

2）依据胶的大小剪取膜和滤纸6片，放入预冷的转膜缓冲液中平衡10min，如用PVDF膜，需参照说明书，先用纯甲醇浸泡1-2min，再孵育于预冷的转膜缓冲液中。

3）装配转移三明治：海绵/3层滤纸/胶/膜/3层滤纸/海绵，每层放好后，用试管赶尽气泡。

4）将转移槽置于冰浴中，放入三明治，膜靠近阳极，胶靠近阴极，加入转移缓冲液，插上电极，100V，1h（电流约为0.3A）。

5）转膜结束后，切断电源，取出膜。

6）将膜浸没在5mL丽春红染色液中，置于轨道摇床上室温染色5~10min或更长，直待膜上显示出蛋白条带。

7）清洗：取出膜，用蒸馏水，PBS或者其他适当溶液冲洗至背景清晰后拍照，大概冲洗2~3次，每次5min。

8）脱色：将膜放到0.1N NaOH溶液漂洗5min；倒去洗脱液，再重复一次。

9）清洗：再用蒸馏水清洗膜2~3次，每次5min。

10）将膜置于25mL封闭缓冲液中，在室温下孵育1小时。

11）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。

4.抗体孵育与检测

1）将膜和一抗（RAB11A抗体按照产品应用推荐稀释度）置于10mL一抗稀释缓冲液中在4℃下孵育过夜并不时轻轻晃动。

2）用5mL TBST洗涤三次，每次15min以去除残留的一抗(RAB11A抗体)。

3）将膜和二抗（按照产品应用推荐稀释度）置于10mL封闭缓冲液中孵育1-2小时并不时轻轻晃动。

4）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。

5）最后一次洗膜的同时，按照ECL超敏试剂盒说明书，新鲜配制发光工作液。

6）用平头镊取出膜，搭在滤纸上沥干洗液。将膜完全浸入发光工作液中，与发光工作液充分接触。室温孵育3min，准备立即压片曝光。但勿洗去发光液。

7）显影曝光。

应用^[4][5]

RAB11A抗体可以用于Rab11a在上皮性卵巢癌中的表达及其细胞学功能和作用机制研究

Rab11a在上皮性卵巢癌细胞中的功能研究目的:从肿瘤细胞的增殖、细胞周期分布、侵袭、迁移等方面研究Rab11a在EOC细胞中发挥的生物学功能。

方法:1.培养人正常卵巢上皮细胞HOSEpi C及OC细胞株A2780,SKOV-3,COC1,OVCAR-3;首先用RT-q PCR检测各组细胞株中Rab11a m RNA表达水平,选择其中Rab11a表达较高的细胞株定为H,表达较低的细胞株则为L。2.利用lipofectamine 2000,将Rab11a的sh-RNA以及其对照的sh-NC,转染到H细胞,从而实现下调;将Rab11a的过表达质粒及其对照质粒,转染至L细胞,构建过表达模型。RAB11A抗体Western blotting验证各组细胞中的Rab11a的蛋白水平。3.CCK-8试验检测各组细胞的增殖情况;流式细胞技术(flow cytometry,FCM)检测细胞周期分布情况;转染48 h后,Western blotting检测各组细胞中PCNA和Cyclin D1表达水平。4.细胞划痕试验和Transwell试验进一步检测各组细胞的迁移能力和侵袭水平;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测各组细胞上清液中MMP-2、MMP-9的含量。

RAB11A抗体结果:1.与HOSEpi C细胞相比,四种OC细胞株中Rab11a的m RNA水平均显著升高。其中,在OVCAR-3细胞中Rab11a m RNA表达水平最高,在A2780细胞中则相对较低。因此,本研究使用sh-RNA对OVCAR-3细胞进行转染下调了Rab11a的表达,使用质粒转染A2780细胞上调了Rab11a的表达,构建过表达模型,进行后续试验。2.RAB11A抗体Western blotting结果显示,在OVCAR-3细胞中,Rab11a蛋白的表达在sh-RNA转染组明显低于对照组,而在A2780细胞中,Rab11a蛋白的表达在质粒转染组中明显高于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。3.CCK-8试验结果表明,相比对照组,下调Rab11a显著降低了OVCAR-3细胞的增殖与活性,相反,Rab11a过表达增加了A2780细胞的增殖与活性。FCM分析结果表明,在OVCAR-3细胞中,与对照组相比,sh-RNA转染组G0/G1期的比例显著升高,同时相应的S期和G2期细胞比例降低(P<0.05)。相反,A2780细胞中Rab11a的过表达导致出现相反的趋势。此外,Western blotting结果显示,Rab11a下调促使OVCAR-3细胞增殖相关蛋白PCNA和Cyclin D1的相对表达量均较对照组降低(P<0.05),而在Rab11a过表达的A2780细胞中,PCNA和Cyclin D1的蛋白表达量则较对照组显著升高(P<0.05)。

参考文献

[1]RAB11A Promotes Cell Malignant Progression and Tumor Formation of Prostate Cancer via Activating FAK/AKT Signaling Pathway[J].Chen Weifang;Wang Junjun.Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine.2023

[2]Rab11a promotes the malignant progression of ovarian cancer by inducing autophagy.[J].Wang Yazhuo;Ren Yanan;Li Na;Zhao Jing;Zhao Sufen.Genes&genomics.2022

[3]RAB11A Expression Is Associated With Cancer Aggressiveness Through Regulation of FGFR-Signaling in Lung Squamous Cell Carcinoma.[J].Gombodorj Navchaa;Azuma Yoko;Yokobori Takehiko;ErkhemOchir Bilguun;Kosaka Takayuki;Ohtaki Yoichi;Nakazawa Seshiru;Mogi Akira;Yajima Toshiki;Kuwano Hiroyuki;Saeki Hiroshi;Shirabe Ken.Annals of surgical oncology.2022

[4]A Clinical Diagnostic Value Analysis of Serum CA125,CA199,and HE4 in Women with Early Ovarian Cancer:Systematic Review and Meta-Analysis[J].Qing Xiaolin;Liu Liting;Mao Xiguang;Hussein Ahmed Faeq.Computational and Mathematical Methods in Medicine,2022

[5]王雅卓.Rab11a在上皮性卵巢癌中的表达及其细胞学功能和作用机制研究[D].河北医科大学,2023.