异丙基-beta-D-硫代半乳糖吡喃糖苷

异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)是一种作用极强的诱导剂,不被细菌代谢而十分稳定,因此被实验室广泛应用。IPTG 常用于需要诱导 β-半乳糖苷酶活性的克隆实验。它常与 X-Gal 或 Bluo-Gal 结合使用，用于重组细菌菌落的蓝白筛选，这些菌落可以诱导 lac 操纵子在大肠杆菌中的表达。IPTG 与 lacI 阻遏蛋白结合并改变其构象而发挥作用，防止 β-半乳糖苷酶编码基因 lacZ 的抑制。 E.coli的乳糖操纵子（元）含Z、Y及A三个结构基因，分别编码半乳糖苷酶、透酶和乙酰基转移酶，此外还有一个操纵序列O、一个启动序列P及一个调节 基因I。I基因编码一种阻遏蛋白，后者与O序列结合，使操纵子（元）受阻遏而处于关闭状态。在启动序列P上游还有一个分解（代谢）物基因激 活蛋白（CAP）结合位点。由P序列、O序列和CAP结合位点共同构成lac操纵子的调控区，三个酶的编码基因即由同一调控区调节，实现基因产物的协调表达 。
在没有乳糖存在时，lac操纵子（元）处于阻遏状态。此时，I序列在PI启动序列操纵下表达的Lac阻遏蛋白与O序列结合，阻碍RNA聚合酶与P序列结 合，抑制转录起动。当有乳糖存在时，lac操纵子（元）即可被诱导。在这个操纵子（元）体系中，真正的诱导剂并非乳糖本身。乳糖进入细胞，经β-半乳糖苷酶催化，转变为异乳糖。后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白，使蛋白构象变化，导致阻遏蛋白与O序列解离、发生转录。异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）的作用与异乳糖相同，是一 种作用极强的诱导剂，不被细菌代谢而十分稳定，因此被实验室广泛应用。 1.能诱导酶的合成，但又不被分解的分子，称为安慰诱导物。由于乳糖虽可诱导酶的合成，但又随之分解，产生很多复杂的动力学问题，因此人们常用安慰诱导物来进行各种实验。
2.IPTG不被菌体代谢，为乳糖类似物，一旦进入细胞就会产生持续长久的诱导效果，所以IPTG的诱导效率高，往往只需要很少量(1mmol/L)即可达到理想诱导效果。由于IPTG不被代谢，在胞内专一诱导外源蛋白的表达。不受细胞代谢的影响，诱导效果持续稳定。乳糖有双效作用，既能做为诱导剂异乳糖的前体物质，又可以做碳源，在诱导过程中，很不稳定，IPTG因其优异的稳定性决定了它适合做实验研究用。
3.IPTG能在缺乏lacY基因下而有效地被抄送。
4.半乳糖苷键中用硫代替了氧，失去了水解活性，但硫代半乳糖苷和同源的氧代化合物与酶位点的亲和力相同，IPTG虽不为β–半乳糖苷酶所识别，但它是lac基因簇十分有效的诱导物。
使用方法：首先把IPTG配制成23.83 mg/ml(100 mM)的水溶液，并进行过滤除菌后保存。然后在100 ml的琼脂培养基中，加入100 μl的上述溶液、200 μl的X-Gal(20 mg/ml的二甲基甲酰胺(DMF)溶液)和100 μl的Amp(100 mg/ml)，制作成IPTG、X-Gal、Amp平板培养基。当dna片段插入至pUC系列载体(或其他带有lacZ、Amp基因载体)，然后转化至lacZ缺失细胞中后，涂布上述的IPTG、X–Gal、Amp平板培养基，可根据长出菌体的蓝白色，而方便地挑选出基因重组体(白色为具有DNA插入片段的基因重组体)。 1、诱导表达材料：
( 1 ) LB (Luria—Bertani))培养基：
酵母膏 (Yeast extract) 5g 蛋白胨 (Peptone) 10g
NaCl 10g 琼脂 (Agar) 1-2%
蒸馏水 (Distilled water) 1000ml pH 7.0
适用范围：大肠杆菌
( 2 ) IPTG 贮备液：
2 g IPTG溶于10 mL 蒸馏水中,0 . 22 μm 滤膜过滤除菌,分装成1 mL /份,-20 ℃ 保存.
( 3 ) l× 凝胶电泳加样缓冲液：
50 mmol / L Tris -CI ( pH 6 . 8 )
50 mmol / L DTT
2 % SDS (电泳级)
0.1 % 溴酚蓝
10 % 甘油
2、大肠杆菌包涵体的分离与蛋白纯化材料：
1 )酶溶法
(1)裂解缓冲液：
50 mmol / L Tris-CI ( pH 8 . 0 )
1 mmol / L EDTA
100 mmol / LNaCI
(2)50 mmol / L 苯甲基磺酰氟(PMSF ).
(3)10 mg / mL 溶菌酶.
(4)脱氧胆酸.
(5)1 mg / mL DNase I.
2 )超声破碎法
( 1 ) TE 缓冲液.
( 2 ) 2×SDS -PAGE 凝胶电泳加样缓冲液：
100 mmol / L Tris-HCI ( pH 8 . 0 )
100 mmol / L DTT
4 %SDS
0.2 % 溴酚蓝
20 % 甘油 1、外源基因的诱导表达：
(1)用适当的限制性内切核酸酶消化载体DNA 和目的基因.
( 2 )按连接步骤连接目的基因和载体,并转化到相应的宿主菌.
( 3 )筛选出含重组子的转化菌落,提取质粒DNA 作限制性内切核酸酶图谱,DNA 序列测定,
确定无误后进行下一步.
( 4 )如果表达载体的原核启动子为PL 启动子,则在30 -32 ℃ 培养数小时,使培养液的OD600达0.4-0.6 ,迅速使温度升至42 ℃ 继续培养3 -5h ;如果表达载体的原核启动子为tac 等,则37 ℃培养细菌数小时达到对数生长期后加IPTG 至终浓度为1 mmol / L.继续培养3 -5h .
( 5 )取上述培养液1 mL , 1000g 离心,1 min ,沉淀,加100 μL 聚丙烯酰胺凝胶电泳上样缓冲液后,作SDS -PAGE 检测.
2、大肠杆菌包涵体的分离与蛋白质纯化：
细菌的裂解
常用方法有：① 高温珠磨法;② 高压匀浆;③ 超声破碎法;④ 酶溶法;⑤ 化学渗透等.前三种方法属机械破碎法,并且方法① 、② 已在工业生产中得到应用,后三种方法在实验室研究中应用较为广泛.下面介绍酶溶法和超声破碎法的实验步骤.
酶溶法.常用的溶解酶有溶菌酶;β-1,3 -葡聚糖酶;β-1,6 -葡聚糖酶;蛋白酶;壳多糖酶;糖昔酶等.溶菌酶主要对细菌类有作用,而其他几种酶对酵母作用显著.主要步骤为：
4 ℃ ,5000rpm 离心,15 min ,收集诱导表达的细菌培养液(100 mL ).弃上清,约每克湿菌加3 mL 裂解缓冲液,悬浮沉淀. 常用分子生物学试剂，常用于蓝白斑筛选及IPTG诱导的细菌内的蛋白表达等 是β-半乳糖苷酶和β-半乳糖透酶的诱导剂，不被β-半乳糖苷水解，是硫代半乳糖转酰酶的底物 IPTG 常用于需要诱导 β-半乳糖苷酶活性的克隆实验。它常与 X-Gal 或 Bluo-Gal 结合使用，用于重组细菌菌落的蓝白筛选，这些菌落可以诱导 lac 操纵子在大肠杆菌中的表达。IPTG 与 lacI 阻遏蛋白结合并改变其构象而发挥作用，防止 β-半乳糖苷酶编码基因 lacZ 的抑制。