BNIP3L抗体的应用

背景^[1-3]

BNIP3L抗体是一种可以特异性结合BNIP3L的人工合成抗体，可以靶向结合人、小鼠、大鼠和猪样品中的BNIP3L蛋白。BNIP3L抗体可用于多种科学应用，包括Western Blot、免疫组织化学、免疫细胞化学、免疫沉淀和ELISA。

BNIP3L，也称为Nix，是一种位于外膜的线粒体蛋白，属于BCL2家族中仅BH3的蛋白。BNIP3L最初被认为具有促凋亡作用，与其他家族成员相比，它表现出较温和的凋亡功效。其主要作用包括在网织红细胞发育过程中清除线粒体。BNIP3L作为线粒体自噬受体发挥作用，与Atg8蛋白结合，尤其是通过缺氧诱导因子1α(HIF1A)的转录上调而由缺氧诱导。这使得BNIP3L介导的线粒体自噬成为对缺氧应激的典型反应。

BNIP3L抗体

BNIP3L抗体使用步骤（Western Blot）：

1.样本制备

1）融解RIPA裂解液（RIPA裂解液-细胞/组织裂解液缓冲液），混匀。

2）贴壁细胞：去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。

3）充分裂解后，10000-14000g离心3-5min，取上清，即可进行后续的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。

2.蛋白电泳

1）取出预制胶，将预制胶固定在电泳槽中，内槽加满tris-glycine电泳缓冲液。

2）在室温或不超过37℃的水浴中溶解5XSDS-PAGE上样缓冲液。水浴溶解后立即室温存放。

3）混合蛋白样品和5XSDS-PAGE蛋白上样缓冲液。

4）100℃或沸水浴加热3-5min，以充分变性蛋白，之后冷却至室温备用。

5）上样蛋白，并在1个孔中上样蛋白marker，盖上电泳槽盖，打开电源，电泳至蓝色染料到达胶的底端处附近即可停止电泳。

6）电泳后取出胶板，用刀在侧边硅胶处，沿着两片玻璃缝隙切开硅胶，即可打开玻璃板；取胶时。

3.转膜与封闭

1）将胶浸于预冷的转膜缓冲液中平衡5min。

2）依据胶的大小剪取膜和滤纸6片，放入预冷的转膜缓冲液中平衡10min，如用PVDF膜，需参照说明书，先用纯甲醇浸泡1-2min，再孵育于预冷的转膜缓冲液中。

3）装配转移三明治：海绵/3层滤纸/胶/膜/3层滤纸/海绵，每层放好后，用试管赶尽气泡。

4）将转移槽置于冰浴中，放入三明治，膜靠近阳极，胶靠近阴极，加入转移缓冲液，插上电极，100V，1h（电流约为0.3A）。

5）转膜结束后，切断电源，取出膜。

6）将膜浸没在5mL丽春红染色液中，置于轨道摇床上室温染色5~10min或更长，直待膜上显示出蛋白条带。

7）清洗：取出膜，用蒸馏水，PBS或者其他适当溶液冲洗至背景清晰后拍照，大概冲洗2~3次，每次5min。

8）脱色：将膜放到0.1N NaOH溶液漂洗5min；倒去洗脱液，再重复一次。

9）清洗：再用蒸馏水清洗膜2~3次，每次5min。

10）将膜置于25mL封闭缓冲液中，在室温下孵育1小时。

11）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。

4.抗体孵育与检测

1）将膜和一抗（BNIP3L抗体按照产品应用推荐稀释度）置于10mL一抗稀释缓冲液中在4℃下孵育过夜并不时轻轻晃动。

2）用5mL TBST洗涤三次，每次15min以去除残留的一抗(BNIP3L抗体)。

3）将膜和二抗（按照产品应用推荐稀释度）置于10mL封闭缓冲液中孵育1-2小时并不时轻轻晃动。

4）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。

5）最后一次洗膜的同时，按照ECL超敏试剂盒说明书，新鲜配制发光工作液。

6）用平头镊取出膜，搭在滤纸上沥干洗液。将膜完全浸入发光工作液中，与发光工作液充分接触。室温孵育3min，准备立即压片曝光。但勿洗去发光液。

7）显影曝光。

应用^[4][5]

BNIP3L抗体可以用于功能磁共振成像在评估对比剂诱导鼠急性肾损伤中的应用及其发病机制与2型糖尿病关系的研究

关于CI-AKI的发生机制研究大多集中在氧化应激和对比剂毒性作用所带来的肾小管上皮和血管内皮细胞的损伤上,很少有关于免疫反应在CI-AKI的研究,肾脏细胞的损伤途径也没有完全清楚。此外,有不少研究发现糖尿病(DM)和(或)糖尿病肾病(DN)是CI-AKI的危险因素,其中的机制尚不明确。最后,由于目前还没有一种可以无创检测和预测CI-AKI的方法,临床上发现CI-AKI时BUN和sCr已经升高,肾功能已经进一步下降。与传统的结构磁共振成像相比,功能磁共振成像(fMRI)可以反映组织器官的功能情况,fMRI可能为CI-AKI的检测提供新的方法和思路。

目的1.探索CI-AKI发生的免疫机制及其中可能出现的不同细胞损伤和死亡方式;2.探索DM如何成为CI-AKI危险因素;3.探索fMRI评估CI-AKI的方法;4.总结CI-AKI的发生机制及阐述其与DM的关系。方法第一部分1.磁共振图像获取和CI-AKI模型建立:共计18只雄性C57BL/6小鼠编号(01-18),异氟烷麻醉,用9.4T磁共振的不同序列(T1WI,T2WI,DTI和BOLD)对小鼠肾脏进行扫描;禁食、禁饮24h后通过尾静脉给其中15只小鼠注射碘克沙醇320,剂量4 g(I)/kg,建立C57BL/6小鼠CI-AKI模型,另外3只注射等量生理盐水,在注射对比剂后的五个不同时间内(1,12,24,48,72 h)用9.4T磁共振的不同序列(如前)扫描小鼠肾脏(每个时间3只,生理盐水3只)。2.图像分析:观察小鼠肾脏的图像特征;用软件ImageJ获取图像ROIs并进行灰度值测量。3.取材:处死所有小鼠,右肾用4%多聚甲醛固定,后续制作肾脏冠状位石蜡切片,左肾-80℃保存,后续提取蛋白;收集血液离心,取血清-80℃保存。4.获取微观图像:石蜡切片制作和H&E染色,显微镜下观察小鼠肾脏微观结构变化并评估肾脏损伤情况,进行组织学评分。5.免疫组化染色:用Ly6G和Nlrp3抗体对小鼠肾脏石蜡切片行免疫组化染色,显微镜下评估染色情况,做H-score评分。6.对磁共振图像的灰度值和组织病理学评分进行相关性分析。7.用ELISA分析小鼠血清NGAL。8.用BNIP3L抗体Western Blot分析小鼠肾脏某些蛋白(Nlrp3,NF-κB,cas8,casl,BNIP3L/Nix,Bc12,BAX,CytoC,GAPDH)的表达。

参考文献

[1]The Application of Functional Magnetic Resonance Imaging in Type 2 Diabetes Rats With Contrast-Induced Acute Kidney Injury and the Associated Innate Immune Response[J].Li Yanfei;Shi Dafa;Zhang Haoran;Yao Xiang;Wang Siyuan;Wang Rui;Ren Ke.Frontiers in Physiology.2021

[2]Contrast-induced nephropathy and oxidative stress:mechanistic insights for better interventional approaches.[J].Kusirisin Prit;Chattipakorn Siriporn C;Chattipakorn Nipon.Journal of translational medicine.2020

[3]Interplay Between NLRP3 Inflammasome and Autophagy.[J].Biasizzo Monika;KopitarJerala Nataša.Frontiers in immunology.2020

[4]Hypoxia inducible factors and diabetes.[J].Gunton Jenny E.The Journal of clinical investigation.2020

[5]李彦飞.功能磁共振成像在评估对比剂诱导鼠急性肾损伤中的应用及其发病机制与2型糖尿病关系的研究[D].厦门大学,2022