VAMP2抗体的应用

背景^[1-3]

VAMP2抗体是一种可以特异性结合VAMP2的人工合成抗体，可以靶向结合人、小鼠、大鼠和猪样品中的VAMP2蛋白。VAMP2抗体可用于多种科学应用，包括Western Blot、免疫组织化学、免疫细胞化学、免疫沉淀和ELISA。

VAMP2，即囊泡相关膜蛋白2，别名synaptobrevin-2。它是一种在神经递质释放过程中起关键作用的蛋白质，主要在神经系统特异表达。VAMP2作为可溶性细胞膜的关键成分之一，参与形成SNARE（可溶性细胞膜因子附着蛋白受体）复合体，与syntaxin-1A和SNAP-25结合产生诱导融合孔形成的力量，从而介导突触小泡的融合和神经递质的释放。VAMP2在生物学上的意义非常重大，它不仅参与神经递质的正常释放，影响神经系统的信号传递，还与多种神经退行性疾病和精神疾病的发生发展有关。VAMP2的活性受到多种因素的精细调控，包括蛋白质、脂质、代谢离子等。研究表明，VAMP2在不同区域的突触小泡膜上展现出不同的构象，胆固醇丰富的微域对其构象和SNARE组装有重要影响。此外，VAMP2的膜结合特性和活性状态在突触前细胞质中受到严格调控，这对于神经递质释放的时空精度至关重要。

VAMP2抗体

VAMP2抗体使用步骤（Western Blot）：

1.样本制备

1）融解RIPA裂解液（RIPA裂解液-细胞/组织裂解液缓冲液），混匀。

2）贴壁细胞：去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。

3）充分裂解后，10000-14000g离心3-5min，取上清，即可进行后续的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。

2.蛋白电泳

1）取出预制胶，将预制胶固定在电泳槽中，内槽加满tris-glycine电泳缓冲液。

2）在室温或不超过37℃的水浴中溶解5XSDS-PAGE上样缓冲液。水浴溶解后立即室温存放。

3）混合蛋白样品和5XSDS-PAGE蛋白上样缓冲液。

4）100℃或沸水浴加热3-5min，以充分变性蛋白，之后冷却至室温备用。

5）上样蛋白，并在1个孔中上样蛋白marker，盖上电泳槽盖，打开电源，电泳至蓝色染料到达胶的底端处附近即可停止电泳。

6）电泳后取出胶板，用刀在侧边硅胶处，沿着两片玻璃缝隙切开硅胶，即可打开玻璃板；取胶时。

3.转膜与封闭

1）将胶浸于预冷的转膜缓冲液中平衡5min。

2）依据胶的大小剪取膜和滤纸6片，放入预冷的转膜缓冲液中平衡10min，如用PVDF膜，需参照说明书，先用纯甲醇浸泡1-2min，再孵育于预冷的转膜缓冲液中。

3）装配转移三明治：海绵/3层滤纸/胶/膜/3层滤纸/海绵，每层放好后，用试管赶尽气泡。

4）将转移槽置于冰浴中，放入三明治，膜靠近阳极，胶靠近阴极，加入转移缓冲液，插上电极，100V，1h（电流约为0.3A）。

5）转膜结束后，切断电源，取出膜。

6）将膜浸没在5mL丽春红染色液中，置于轨道摇床上室温染色5~10min或更长，直待膜上显示出蛋白条带。

7）清洗：取出膜，用蒸馏水，PBS或者其他适当溶液冲洗至背景清晰后拍照，大概冲洗2~3次，每次5min。

8）脱色：将膜放到0.1N NaOH溶液漂洗5min；倒去洗脱液，再重复一次。

9）清洗：再用蒸馏水清洗膜2~3次，每次5min。

10）将膜置于25mL封闭缓冲液中，在室温下孵育1小时。

11）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。

4.抗体孵育与检测

1）将膜和一抗（VAMP2抗体按照产品应用推荐稀释度）置于10mL一抗稀释缓冲液中在4℃下孵育过夜并不时轻轻晃动。

2）用5mL TBST洗涤三次，每次15min以去除残留的一抗(VAMP2抗体)。

3）将膜和二抗（按照产品应用推荐稀释度）置于10mL封闭缓冲液中孵育1-2小时并不时轻轻晃动。

4）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。

5）最后一次洗膜的同时，按照ECL超敏试剂盒说明书，新鲜配制发光工作液。

6）用平头镊取出膜，搭在滤纸上沥干洗液。将膜完全浸入发光工作液中，与发光工作液充分接触。室温孵育3min，准备立即压片曝光。但勿洗去发光液。

7）显影曝光。

应用^[4][5]

VAMP2抗体可以用于Rab10 Thr73位点磷酸化在脑内的生理作用研究

研究目的:1.探讨Rab10 Thr73位点磷酸化对小鼠行为学表型的影响;2.探讨Rab10 Thr73位点磷酸化影响的主要脑区和细胞类型;3.探讨Rab10 Thr73位点磷酸化对脑内神经元形态、功能的影响及其分子机制。

研究方法:1.构建模拟Rab10持续非磷酸化和持续磷酸化状态的小鼠模型利用CRISPR/Cas9技术,分别构建模拟Rab10持续非磷酸化状态和持续磷酸化状态的Rab10 T73V和T73D突变小鼠模型,并利用DNA测序、免疫蛋白印迹(Western Blot,WB)对Rab10的突变和表达水平进行了验证。

2.检测Rab10突变小鼠的行为学表型对3月龄Rab10T73V/T73V小鼠和3月龄、5月龄、7月龄和9月龄Rab10T73D/+小鼠及同窝Rab10+/+小鼠进行一系列的行为学检测,包括:旷场试验、高架十字迷宫试验、明暗箱试验、Y迷宫试验、○迷宫试验、T迷宫试验、藏宝试验、筑巢试验、巴恩斯迷宫、加速旋转杆试验、悬尾试验、强迫游泳试验、条件性恐惧试验、代谢笼和新物体识别试验,用以检测小鼠自发活动度、焦虑样行为、重复性强迫样行为、学习记忆、抑郁样行为、运动协调能力和能量代谢等方面的表型。

3.检测Rab10突变小鼠突触结构和功能的改变提取Rab10+/+及Rab10T73V/T73V小鼠纹状体、杏仁核、背侧海马、腹侧海马和前额叶皮层这5个与焦虑行为相关的脑区蛋白,VAMP2抗体WB检测VAMP1、VAMP2、Syntaxin 1、SHANK2、Synaptophysin、PSD95等突触蛋白的表达水平,确定Rab10 T73V突变影响的主要脑区。再对实验中确定的责任脑区——纹状体进行针对性检测:利用脑片膜片钳,记录中型棘突神经元(medium spiny neuron,MSN)微小抑制性突触后电流(miniature inhibitory postsynaptic current,mIPSC)和微小兴奋性突触后电流(miniature excitatory postsynaptic current,mEPSC),以检测突触功能;利用透射电镜观察突触密度、突触小泡的密度和直径、突触后致密斑的长度和宽度;对纹状体脑区进行抑制性突触前、后标志物GAD67和Gephyrin,兴奋性突触前、后标志物VGLUT1和PSD95的免疫荧光染色,分析抑制性突触和兴奋性突触的密度。

参考文献

[1]Differential contributions of ventral striatum subregions to the motivational and hedonic components of the affective processing of reward.[J].Pool Eva R;Munoz Tord David;Delplanque Sylvain;Stussi Yoann;Cereghetti Donato;Vuilleumier Patrik;Sander David.The Journal of neuroscience:the official journal of the Society for Neuroscience.2022

[2]The Regulation of Rab GTPases by Phosphorylation[J].Xu Lejia;Nagai Yuki;Kajihara Yotaro;Ito Genta;Tomita Taisuke.Biomolecules.2021

[3]Dorsolateral Striatal Task initiation Bursts Represent Past Experiences More than Future Action Plans.[J].Cunningham Paul J;Regier Paul S;Redish A David.The Journal of neuroscience:the official journal of the Society for Neuroscience.2021

[4]Defective insulin-stimulated GLUT4 translocation in brown adipocytes induces systemic glucose homeostasis dysregulation independent of thermogenesis in female mice.[J].Picatoste Belén;Yammine Lucie;Leahey Rosemary A;Soares David;Johnson Emma F;Cohen Paul;McGraw Timothy E.Molecular metabolism.2021

[5]张菁.Rab10 Thr73位点磷酸化在脑内的生理作用研究[D].山东大学,2023.