ACAA1抗体的应用

背景^[1-3]

ACAA1抗体是一种可以特异性结合ACAA1的人工合成抗体，可以靶向结合人、小鼠、大鼠和猪样品中的ACAA1蛋白。ACAA1抗体可用于多种科学应用，包括Western Blot、免疫组织化学、免疫细胞化学、免疫沉淀和ELISA。

ACAA1抗体（C-8）既有非偶联型抗ACAA1抗体形式，也有多种偶联型抗ACAA1抗体形式，包括琼脂糖、HRP、PE、FITC和多种Alexa Fluor®偶联物。哺乳动物组织含有五种硫解酶，它们都参与体内各种化合物的代谢。ACAA1（乙酰辅酶A酰基转移酶1），也称为过氧化物酶体3-氧代酰基辅酶A硫解酶，是硫解酶家族酶的424个氨基酸成员，参与脂质代谢。ACAA1定位于过氧化物酶体，在脂肪酸氧化途径中催化酰基辅酶A和乙酰辅酶A转化为3-氧代酰基辅酶A。ACAA1在大鼠的肝、肾、肠和白色脂肪组织中显示出高酶活性，存在A型和B型两种类型。人类ACAA1与其大鼠对应物具有86%的氨基酸同一性，这表明ACAA1在不同物种间具有保守功能。

ACAA1抗体

ACAA1抗体使用步骤（Western Blot）：

1.样本制备

1）融解RIPA裂解液（RIPA裂解液-细胞/组织裂解液缓冲液），混匀。

2）贴壁细胞：去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。

3）充分裂解后，10000-14000g离心3-5min，取上清，即可进行后续的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。

2.蛋白电泳

1）取出预制胶，将预制胶固定在电泳槽中，内槽加满tris-glycine电泳缓冲液。

2）在室温或不超过37℃的水浴中溶解5XSDS-PAGE上样缓冲液。水浴溶解后立即室温存放。

3）混合蛋白样品和5XSDS-PAGE蛋白上样缓冲液。

4）100℃或沸水浴加热3-5min，以充分变性蛋白，之后冷却至室温备用。

5）上样蛋白，并在1个孔中上样蛋白marker，盖上电泳槽盖，打开电源，电泳至蓝色染料到达胶的底端处附近即可停止电泳。

6）电泳后取出胶板，用刀在侧边硅胶处，沿着两片玻璃缝隙切开硅胶，即可打开玻璃板；取胶时。

3.转膜与封闭

1）将胶浸于预冷的转膜缓冲液中平衡5min。

2）依据胶的大小剪取膜和滤纸6片，放入预冷的转膜缓冲液中平衡10min，如用PVDF膜，需参照说明书，先用纯甲醇浸泡1-2min，再孵育于预冷的转膜缓冲液中。

3）装配转移三明治：海绵/3层滤纸/胶/膜/3层滤纸/海绵，每层放好后，用试管赶尽气泡。

4）将转移槽置于冰浴中，放入三明治，膜靠近阳极，胶靠近阴极，加入转移缓冲液，插上电极，100V，1h（电流约为0.3A）。

5）转膜结束后，切断电源，取出膜。

6）将膜浸没在5mL丽春红染色液中，置于轨道摇床上室温染色5~10min或更长，直待膜上显示出蛋白条带。

7）清洗：取出膜，用蒸馏水，PBS或者其他适当溶液冲洗至背景清晰后拍照，大概冲洗2~3次，每次5min。

8）脱色：将膜放到0.1N NaOH溶液漂洗5min；倒去洗脱液，再重复一次。

9）清洗：再用蒸馏水清洗膜2~3次，每次5min。

10）将膜置于25mL封闭缓冲液中，在室温下孵育1小时。

11）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。

4.抗体孵育与检测

1）将膜和一抗（ACAA1抗体按照产品应用推荐稀释度）置于10mL一抗稀释缓冲液中在4℃下孵育过夜并不时轻轻晃动。

2）用5mL TBST洗涤三次，每次15min以去除残留的一抗(ACAA1抗体)。

3）将膜和二抗（按照产品应用推荐稀释度）置于10mL封闭缓冲液中孵育1-2小时并不时轻轻晃动。

4）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。

5）最后一次洗膜的同时，按照ECL超敏试剂盒说明书，新鲜配制发光工作液。

6）用平头镊取出膜，搭在滤纸上沥干洗液。将膜完全浸入发光工作液中，与发光工作液充分接触。室温孵育3min，准备立即压片曝光。但勿洗去发光液。

7）显影曝光。

应用^[4][5]

ACAA1抗体可以用于喉鳞状细胞癌中脂肪酸代谢相关基因ADRP和ACAA1异常表达的研究

喉癌是头颈部最常见的恶性肿瘤之一,其中绝大多数为喉鳞状细胞癌(Laryngeal squamous cell carcinoma,LSCC),近年来其发病率呈上升趋势,其发病机制尚不甚清楚,因此学者们致力于探索喉癌发生发展机制。肿瘤细胞能量代谢改变如Warburg效应在肿瘤增殖、调亡、转移等方面发挥重要作用。脂肪酸是能量代谢的重要底物,肿瘤细胞中脂肪酸代谢呈异常激活状态,脂肪酸代谢相关基因表达水平的改变可能影响肿瘤细胞的生物学行为。

探讨喉鳞状细胞癌中脂肪酸代谢机制,我们开展本课题研究即脂肪酸代谢相关基因脂肪相关分化蛋白(Adipose differentiation-related protein,ADRP)和乙酰辅酶A酰基转移酶(Acetyl CoA acyltransferase 1,ACAA1)基因在LSCC中的表达特点,分析其表达与临床病理参数的关系,为进一步的实验研究提供理论基础。研究方法1.通过实时荧光定量PCR方法检测LSCC中的ADRP和ACAA1基因的转录水平。2.通过用ACAA1抗体免疫组织化学染色法从蛋白水平检测LSCC中ADRP和ACAA1的异常表达。3.结合LSCC样本的临床特征,分析脂肪酸代谢基因ADRP和ACAA1与喉癌发生发展的关系。

ACAA1抗体研究结果1.检测发现相对于癌旁组织,ADRP和ACAA1在LSCC中转录水平下调。2.LSCC中ADRP和ACAA1的蛋白水平呈明显表达下调。3.ADRP和ACAA1的表达与LSCC的TNM分期、分化程度有关。研究结论脂肪酸代谢相关基因ADRP和ACAA1在LSCC中异常表达,此外与LSCC的TNM分期、病理分级有关,提示了ADRP和ACAA1的异常表达可能参与LSCC的发生发展过程,为探索LSCC的发生机制提供新的思路。

参考文献

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[3]Acetate/acetyl-CoA metabolism associated with cancer fatty acid synthesis:Overview and application[J].Yukie Yoshii;;Takako Furukawa;;Tsuneo Saga;;Yasuhisa Fujibayashi.Cancer Letters.2015

[4]The combinatory effects of PPAR-γagonist and survivin inhibition onthe cancer stem-like phenotype and cell proliferation in bladder cancer cells[J].Yang Wang;;Hailin Tan;;Dongxu Xu;;Aihui Ma;;Li Zhang;;Jiabin Sun;;Zhaojuan Yang;;Yongzhong Liu;;Guowei Shi.International Journal of Molecular Medicine,2014(1)

[5]黄润春.喉鳞状细胞癌中脂肪酸代谢相关基因ADRP和ACAA1异常表达的研究[D].广西医科大学,2017.