DDR1抗体的应用

背景^[1-3]

DDR1抗体是一种可以特异性结合DDR1的人工合成抗体，可以靶向结合人、小鼠、大鼠和猪样品中的DDR1蛋白。DDR1抗体可用于多种科学应用，包括Western Blot、免疫组织化学、免疫细胞化学、免疫沉淀和ELISA。

DDR1（Discoidin domain receptor 1）作为DDRs成员之一，属于一种新型的受体型酪氨酸激酶（RTKs）。DDR1基因位于人6号染色体的p臂（6p21.3）。DDR1由与配体相互作用的细胞外结构域、跨膜区和通过激酶结构域传递信号的细胞质内结构组成。DDR1有5种亚型，即5个剪接变异体，DDR1a、DDR1b、DDR1c、DDR1d和DDR1e，由外显子的选择性剪接或缺失产生。目前，被证实有生物学功能的亚型为DDR1a和DDR1b。研究表明，不少蛋白能与活化后的DDR1结合，非肌肉肌球蛋白重链IIA（Non-myscle myosin heavy chain IIA,NMHC-IIA），黏着斑激酶（Focal adhesion kinase，FAK），STAT3，Lyn等。但某些蛋白与DDR1的结合不需要DDR1的磷酸化，如多巴胺和cAMP调节的磷蛋白、肾脑表达蛋白、Notch1、E-钙黏蛋白（Cadherin-1，CADH1）。

DDR1主要表达于上皮细胞，平滑肌细胞、成纤维细胞、少突胶质细胞和巨噬细胞，且DDR1与肾脏、肝脏、肺组织的纤维化病变有关。此外，DDR1酪氨酸激酶在多种肿瘤中均有表达，如肺癌、乳腺癌、脑瘤、卵巢癌、食管癌、头颈部肿瘤、肝癌、睾丸癌等，其高表达与肿瘤预后不良密切相关。鉴于DDR1功能的改变和肿瘤的发展之间的联系，使得DDR1成为癌症治疗的新靶点。目前，已有多款靶向DDR1在研临床药物，主要用于癌症治疗。

DDR1抗体

DDR1抗体使用步骤（Western Blot）：

1.样本制备

1）融解RIPA裂解液（RIPA裂解液-细胞/组织裂解液缓冲液），混匀。

2）贴壁细胞：去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。

3）充分裂解后，10000-14000g离心3-5min，取上清，即可进行后续的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。

2.蛋白电泳

1）取出预制胶，将预制胶固定在电泳槽中，内槽加满tris-glycine电泳缓冲液。

2）在室温或不超过37℃的水浴中溶解5XSDS-PAGE上样缓冲液。水浴溶解后立即室温存放。

3）混合蛋白样品和5XSDS-PAGE蛋白上样缓冲液。

4）100℃或沸水浴加热3-5min，以充分变性蛋白，之后冷却至室温备用。

5）上样蛋白，并在1个孔中上样蛋白marker，盖上电泳槽盖，打开电源，电泳至蓝色染料到达胶的底端处附近即可停止电泳。

6）电泳后取出胶板，用刀在侧边硅胶处，沿着两片玻璃缝隙切开硅胶，即可打开玻璃板；取胶时。

3.转膜与封闭

1）将胶浸于预冷的转膜缓冲液中平衡5min。

2）依据胶的大小剪取膜和滤纸6片，放入预冷的转膜缓冲液中平衡10min，如用PVDF膜，需参照说明书，先用纯甲醇浸泡1-2min，再孵育于预冷的转膜缓冲液中。

3）装配转移三明治：海绵/3层滤纸/胶/膜/3层滤纸/海绵，每层放好后，用试管赶尽气泡。

4）将转移槽置于冰浴中，放入三明治，膜靠近阳极，胶靠近阴极，加入转移缓冲液，插上电极，100V，1h（电流约为0.3A）。

5）转膜结束后，切断电源，取出膜。

6）将膜浸没在5mL丽春红染色液中，置于轨道摇床上室温染色5~10min或更长，直待膜上显示出蛋白条带。

7）清洗：取出膜，用蒸馏水，PBS或者其他适当溶液冲洗至背景清晰后拍照，大概冲洗2~3次，每次5min。

8）脱色：将膜放到0.1N NaOH溶液漂洗5min；倒去洗脱液，再重复一次。

9）清洗：再用蒸馏水清洗膜2~3次，每次5min。

10）将膜置于25mL封闭缓冲液中，在室温下孵育1小时。

11）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。

4.抗体孵育与检测

1）将膜和一抗（DDR1抗体按照产品应用推荐稀释度）置于10mL一抗稀释缓冲液中在4℃下孵育过夜并不时轻轻晃动。

2）用5mL TBST洗涤三次，每次15min以去除残留的一抗(DDR1抗体)。

3）将膜和二抗（按照产品应用推荐稀释度）置于10mL封闭缓冲液中孵育1-2小时并不时轻轻晃动。

4）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。

5）最后一次洗膜的同时，按照ECL超敏试剂盒说明书，新鲜配制发光工作液。

6）用平头镊取出膜，搭在滤纸上沥干洗液。将膜完全浸入发光工作液中，与发光工作液充分接触。室温孵育3min，准备立即压片曝光。但勿洗去发光液。

7）显影曝光。

应用^[4][5]

DDR1抗体可以用于盘状结构域受体1在肝纤维化发生发展中的作用及机制研究

探索了DDR1在肝纤维化发生发展过程中的作用及其潜在分子机制。方法:1.相同遗传背景的野生(WT)小鼠和DDR1基因敲除(KO)小鼠通过腹腔注射CCL4(0.5mL/kg)建立肝纤维化模型,采集外周血并收集肝脏进行分析。通过血清生化指标测定,组织病理学观察及纤维化指标的检测,分析DDR1与肝纤维化的相关性。2.建立肝细胞与肝星状细胞的间接共培养体系,体外研究肝细胞DDR1对肝星状细胞的影响。通过慢病毒转染构建DDR1高表达或敲减的肝细胞L02和HepG2细胞株,在Ⅰ型胶原刺激后收集肝细胞条件上清,用上述条件上清孵育LX2细胞后研究DDR1对肝星状细胞活化表型、增殖能力及胶原合成的促纤维化特性的影响。通过Ⅰ型胶原刺激不同DDR1表达水平肝细胞后,DDR1抗体检测DDR1对肝细胞上清液中细胞因子表达的影响,并使用中和抗体对肝细胞条件上清进行干预后观察肝细胞DDR1对肝星状细胞相关促纤维化特性的影响,以阐明DDR1通过对肝细胞旁分泌作用的调控来影响肝星状细胞促纤维化特性的作用。3.检测在Ⅰ型胶原刺激下肝细胞DDR1的活化,相关细胞因子的表达和相关通路蛋白的活化,在通路蛋白抑制剂预处理后再次检测相关细胞因子的表达,通过探究参与DDR1调控肝细胞促纤维化因子表达的相关信号通路来进一步阐明DDR1调控肝细胞促纤维化介质表达的分子机制。

参考文献

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[5]蒙颖.盘状结构域受体1在肝纤维化发生发展中的作用及机制研究[D].兰州大学,2023.