IFITM1抗体的应用

背景^[1-3]

IFITM1抗体是一种可以特异性结合IFITM1的人工合成抗体，可以靶向结合人、小鼠、大鼠和猪样品中的IFITM1蛋白。IFITM1抗体可用于多种科学应用，包括Western Blot、免疫组织化学、免疫细胞化学、免疫沉淀和ELISA。

IFITM1诱导的抗病毒蛋白，可抑制病毒进入宿主细胞胞质，允许内吞，但阻止随后的病毒融合和病毒内容物释放到细胞质中。对多种病毒具有活性，包括甲型流感病毒、SARS冠状病毒（SARS-CoV）、马尔堡病毒（MARV）、埃博拉病毒（EBOV）、登革热病毒（DNV）、西尼罗河病毒（WNV）、1型人类免疫缺陷病毒（HIV-1）和丙型肝炎病毒（HCV）。可抑制流感病毒血凝素蛋白介导的病毒进入、MARV和EBOV GP1,2介导的病毒进入以及SARS-CoV S蛋白介导的病毒进入。还与细胞粘附和控制细胞生长与迁移有关。

IFITM1抗体

IFITM1抗体使用步骤（Western Blot）：

1.样本制备

1）融解RIPA裂解液（RIPA裂解液-细胞/组织裂解液缓冲液），混匀。

2）贴壁细胞：去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。

3）充分裂解后，10000-14000g离心3-5min，取上清，即可进行后续的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。

2.蛋白电泳

1）取出预制胶，将预制胶固定在电泳槽中，内槽加满tris-glycine电泳缓冲液。

2）在室温或不超过37℃的水浴中溶解5XSDS-PAGE上样缓冲液。水浴溶解后立即室温存放。

3）混合蛋白样品和5XSDS-PAGE蛋白上样缓冲液。

4）100℃或沸水浴加热3-5min，以充分变性蛋白，之后冷却至室温备用。

5）上样蛋白，并在1个孔中上样蛋白marker，盖上电泳槽盖，打开电源，电泳至蓝色染料到达胶的底端处附近即可停止电泳。

6）电泳后取出胶板，用刀在侧边硅胶处，沿着两片玻璃缝隙切开硅胶，即可打开玻璃板；取胶时。

3.转膜与封闭

1）将胶浸于预冷的转膜缓冲液中平衡5min。

2）依据胶的大小剪取膜和滤纸6片，放入预冷的转膜缓冲液中平衡10min，如用PVDF膜，需参照说明书，先用纯甲醇浸泡1-2min，再孵育于预冷的转膜缓冲液中。

3）装配转移三明治：海绵/3层滤纸/胶/膜/3层滤纸/海绵，每层放好后，用试管赶尽气泡。

4）将转移槽置于冰浴中，放入三明治，膜靠近阳极，胶靠近阴极，加入转移缓冲液，插上电极，100V，1h（电流约为0.3A）。

5）转膜结束后，切断电源，取出膜。

6）将膜浸没在5mL丽春红染色液中，置于轨道摇床上室温染色5~10min或更长，直待膜上显示出蛋白条带。

7）清洗：取出膜，用蒸馏水，PBS或者其他适当溶液冲洗至背景清晰后拍照，大概冲洗2~3次，每次5min。

8）脱色：将膜放到0.1N NaOH溶液漂洗5min；倒去洗脱液，再重复一次。

9）清洗：再用蒸馏水清洗膜2~3次，每次5min。

10）将膜置于25mL封闭缓冲液中，在室温下孵育1小时。

11）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。

4.抗体孵育与检测

1）将膜和一抗（IFITM1抗体按照产品应用推荐稀释度）置于10mL一抗稀释缓冲液中在4℃下孵育过夜并不时轻轻晃动。

2）用5mL TBST洗涤三次，每次15min以去除残留的一抗(IFITM1抗体)。

3）将膜和二抗（按照产品应用推荐稀释度）置于10mL封闭缓冲液中孵育1-2小时并不时轻轻晃动。

4）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。

5）最后一次洗膜的同时，按照ECL超敏试剂盒说明书，新鲜配制发光工作液。

6）用平头镊取出膜，搭在滤纸上沥干洗液。将膜完全浸入发光工作液中，与发光工作液充分接触。室温孵育3min，准备立即压片曝光。但勿洗去发光液。

7）显影曝光。

应用^[4][5]

IFITM1抗体可以用于抗IFITM1单克隆抗体的制备及检测

制备抗干扰素诱导的跨膜蛋白-1(interferon-induced transmembrane protein 1,IFITM1)的单克隆抗体,为检测IFITM1及进一步研究其在结肠肿瘤发生过程中的作用提供实验基础。

方法:以结肠癌患者的癌组织为材料,提取总RNA,以RT-PCR扩增得到IFITM1 cDNA序列,经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切后,克隆入pGEX-4T-3进行原核表达并纯化得IFITM1-GST;以该融合蛋白免疫BALB/c小鼠,淋巴细胞杂交瘤法制备单克隆抗体;采用IFITM1抗体ELISA、Western-blot及免疫组织化学法以制备的抗体检测结肠癌患者结肠癌组织中的IFITM1。结果:成功构建了IFITM1原核表达载体,获得了IFITM1-GST重组蛋白;制备得到了1株抗IFITM1单克隆抗体,腹水ELISA效价为1:30000,抗体亚类为IgG1,可用于IFITM1抗体ELISA、Western-blot及免疫组织化学法检测结肠癌患者结肠癌组织中的IFITM1。结论:获得了1株可用于ELISA、Western-blot及免疫组织化学法的抗IFITM1单克隆抗体2F-1,为进一步研究IFITM1在结肠肿瘤发生过程中的作用提供了实验基础。

参考文献

[1]Overexpression of IFITM1 Has Clinicopathologic Effects on Gastric Cancer and Is Regulated by an Epigenetic Mechanism[J].Jieun Lee;;Sung-Ho Goh;;Naaleum Song;;Jung-Ah Hwang;;Seungyoon Nam;;Il Ju Choi;;Aesun Shin;;In-Hoo Kim;;Mi-Ha Ju;;Jin Sook Jeong;;Yeon-Su Lee.The American Journal of Pathology,2012(1)

[2]Activation of CD147 with Cyclophilin A Induces the Expression of IFITM1 through ERK and PI3K in THP-1 Cells[J].Ju-Young Kim;;Ho Kim;;Kyoungho Suk;;Won-Ha Lee;;Steven Kunkel.Mediators of Inflammation,2010

[3]The IFITM Proteins Mediate Cellular Resistance to Influenza A H1N1 Virus,West Nile Virus,and Dengue Virus[J].Abraham L.Brass;;I-Chueh Huang;;Yair Benita;;Sinu P.John;;Manoj N.Krishnan;;Eric M.Feeley;;Bethany J.Ryan;;Jessica L.Weyer;;Louise van der Weyden;;Erol Fikrig;;David J.Adams;;Ramnik J.Xavier;;Michael Farzan;;Stephen J.Elledge.Cell,2009(7)

[4]Selection of a novel drug-response predictor in esophageal cancer:Anovel screening method using microarray and identification of IFITM1 as a potentmarker gene of CDDP response[J].Shoichi Fumoto;;Tatsushi Shimokuni;;Keiji Tanimoto;;Keiko Hiyama;;Keiko Otani;;Megu Ohtaki;;Jun Hihara;;Kazuhiro Yoshida;;Eiso Hiyama;;Tsuyoshi Noguchi;;Masahiko Nishiyama.International Journal of Oncology,2008(2)

[5]刘灏,林智琪,符方勇,等.抗IFITM1单克隆抗体的制备及检测[J].现代生物医学进展,2014,14(09):1606-1610.