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T4DNA连接酶的连接酶保真性

发布日期:2019/4/16 14:05:57

背景及概述[1]

DNA连接酶(EC6。5。1。1)用于体外DNA连接、连接检测PCR,体内冈崎片断连接成完整基因组DNA有重要作用。基因工程所用DNA连接酶由公司提供,最常用的是T4DNA连接酶(T4Lig)。因为应用广泛并由公司提供,较多科研人员常忽略对其性质的全面了解,导致体外平端DNA连接效率很低,转化中出很多问题。T4DNA连接酶来源于T4噬菌体,在体外可在ATP辅助下,催化粘端或平端双链DNA或RNA的5′-P末端和3′-OH末端之间形成磷酸二酯键。由于T4DNA连接酶的连接特性,连接酶是DNA复制过程中复制链的合成所必需的,并参与DNA损伤修复以及染色体重组等重要生命过程的调节,广泛应用于分子克隆中重组DNA的构建等领域。然而目前此种工具酶严重依赖进口,各生产厂家随产品的说明书中规定的参数不统一,使得产品质量状况参差不齐,缺乏一个统一判定标准。

连接酶分子大小[1]

T4Lig由T4嗜菌体30基因合成,最早从T4嗜菌体感染的Ecoli提取。后来发现DNA复制缺失型嗜菌体中连接酶产量更高,从而作为连接酶的主要来源,目前市场供应连接酶通过基因工程方法生产。Murry测定T4Lig分子量为63000~68000Da,Armstrong进一步确定为55,230Da,由487个氨基酸(Aa)残基组成,基因长度1464bp(GenBank序列号为X00039)。按照分子量与分子大小比例关系估算,T4Lig大小约3。4nm,可跨越约1个DNA双螺旋长度(即10bp)。连接酶占据连接端口下游(5’-P端部)7~10bp,占据端口上游(3’-OH端部)3~5bp。只有487Aa的酶分子同时具有连接活性,拓扑异构活性表明其结构、功能比较复杂。与之相比,EcoliDNA连接酶671Aa,分子量74000Da,每个Ecoli细胞含有约300个DNA连接酶分子,与DNA聚合酶分子个数接近,可以满足DNA复制时冈崎片断连接需要,细菌和真核生物中冈崎片断长度分别为1000bp左右和100~200bp。

连接酶保真性[1]

相对于DNA聚合酶,连接酶保真性不太熟悉,特别是DNA体外连接的科研人员。连接酶保真性是指酶分子识别连接端口核苷酸的能力。T4Lig识别连接端口碱基能力较低,从而连接多种异常端口:3’或5’无嘌呤或无嘧啶碱基、缺失1nt的连接端口、3’和5’A-A或T-T配对、5’G-T配对、3’C-A、C-T、T-G、T-T、T-C、A-C、G-G、G-T配对。连接反应中加入亚精胺(spermidine)、高盐缓冲液,或降低连接酶用量可以提高T4Lig保真性。Wu等发现100nMDNA在1UT4Lig,200mM高盐浓度下保真性可提高60倍。随着保真性提高,Km增加4倍,Vmax降低~30倍。酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)DNA连接酶保真性较高,可识别1nt缺失端口和3’A-G或T-G配对端口,但是识别5’A-C、T-C、C-A、G-A匹配能力不高。5’-P端部核苷酸识别能力较低可能与5’-P-AMP复合物的形成有关。与常温作用的T4Lig连接酶(37℃)不同,有些高温作用的DNA连接酶:PyrococcusfuriosusPfu)连接酶、Thermusaquaticus(Taq)连接酶、Thermusthermophilus(Tth)连接酶、Thermotogamaritima(Tma)连接酶。TaqDNA连接酶反应温度45~65℃,TmaDNA连接酶反应温度60℃。TaqDNA连接酶保真性比T4Lig、EcoliDNA连接酶高很多。TthDNA连接酶保真性比T4Lig高24倍。TthDNA连接酶具有3’-5’外切活性,可以切去与模板非匹配碱基。TthDNA连接酶的保真性较高,可能与TthDNA聚合酶3’-5’外切活性较低有关,高温菌TthermophilusDNA合成中很少掺入错配碱基,需要TthDNA连接酶切去冈崎片断连接时错配碱基。TthDNA连接酶中K294R和K294P突变后,既保留了该酶的切口DNA连接活性,又提高了保真性约4倍和11倍。T4Lig识别错配碱基能力较低,可能与T4DNA聚合酶的3’-5’外切活性有关。

连接机理与结构[1]

目前DNA连接反应机理是基于切口双链DNA底物得到的:普遍认为连接反应由三步完成:①T4Lig先由ATP供能产生E-AMP复合物;②E-AMP复合物识别双链DNA切口位置,将AMP转移到5’-P基团,形成5’-P-AMP复合物;③3’-OH亲核攻击5’-P-AMP形成磷酸二酯键,并释放出AMP。在PDB数据库检测不到T4Lig的晶体结构,导致连接机理不完全明了,特别是平端DNA连接机理不完善。以热稳定性PfuDNA连接酶晶体结构为模板,笔者通过同源分子建模模拟T4Lig结构。显示出DNA连接酶有三个保守性结构域:DNA结合结构域DBD,腺苷酰化结构域AdD(adenylaitiondomain,I130~E368),寡核苷酸链结合结构域OBD(oligonucleotide-binding-fold,V369~E482)。腺苷酰化结构域AdD中K159是腺苷酰化位点,通过该位点形成N6-AMP-lysine酶-底物复合物。根据相似性比对发现,R164、R182、R359、K365是ATP结合位点,E217、E344二价金属离子结合位点(UniProtKB登录号:P00970)。

Rossi等切除T4LigN-端80个Aa、C-端57个Aa、C-端137个Aa分别得到NΔ80、C-Δ57、C-Δ137突变体,酶学性质表明N端80个Aa、C端57个Aa在DNA结合中起重要作用。模拟结构显示N端M1~L129是DBD结构域,C端V369~E482是OBD结构域,均与DNA结合有关。端部切除显示E-DNA复合物有两种状态:腺苷酰化酶分子复合物的短暂态:是指ATP将AMP转移到连接酶K159上形成E-AMP复合物;去腺苷酰化态酶分子复合物的稳定态(S·complex):是指E-AMP复合物将AMP转移到连接端口5’-P基团形成5’-P-AMP复合物,需要寻找附近的3-OH,所以此时E-DNA复合物是一种稳定态,稳定态复合物与平端连接有关。K159是T4Lig酶分子腺苷酰化作用位点,K159L突变体表明K159不参与识别DNA、但是K159L突变后酶分子不能完成自身腺苷酰化。在AMP存在下,K159L突变体具有DNA内切活性,可以将超螺旋质粒DNA切成环状切口DNA,解除DNA超螺旋。

活力测定[3]

(1)酶活力测定。按表2配置连接反应体系,反应体系中以ddH2O代替待测酶设置空白对照,以加入能完全连接的酶量(15U/50μL)设置为阳性对照,电泳检测点入λDNA-HindIIIMarker作为分子量对照。

轻轻混匀,16℃反应30min,反应结束后65℃温浴10min,置于冰上。电泳观察连接情况,按连接情况加入酶的最小体积乘以稀释倍数计算酶活力。

(2)灵敏度。分别向连接体系中添加不同模板量,对该方法的模板灵敏度进行考察,按表3配制连接反应体系。

轻轻混匀,16℃反应30min,反应结束后65℃温浴10min,置于冰上。电泳观察连接情况,判断能检测到的连接最低模板量。

(3)重复性。按照表3(λDNA-HindIII加入量为1μg)配制连接体系,配制6个平行反应,16℃反应30min,反应结束后65℃温浴10min,置于冰上,电泳观察连接情况。

(4)稳定性。根据表3(λDNA-HindIII加入量为1μg)配制连接体系,配制2个平行反应,16℃分别反应30min,1,2,4h,连接过夜,电泳观察连接情况。

主要参考资料

[1] 卫生学大辞典

[2] T4 DNA 连接酶性质及其平端连接功能

[3] T4DNA连接酶性质及其平端连接功能