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T4-DNA连接酶的应用

发布日期:2019/6/5 10:17:47

背景[1-6]

T4-DNA连接酶一种封闭DNA链上切口酶,借助ATP或NADP水解提供的能量催化DNA链的5'-PO4与另一DNA链的3'-OH生成磷酸二酯键。但这两条链必须是与同一条互补链配对结合的(T4DNA连接酶除外),而且必须是两条紧邻DNA链才能被DNA连接酶催化形成磷酸二酯键。T4 DNA连接酶可催化相邻DNA链的5’-P末端和3’-OH末端以磷酸二酯键结合的反应,需ATP作辅酶,不仅可以催化粘性末端之间或平滑末端之间的DNA的连接,也可以催化DNA与RNA之间以及少数RNA之间的连接。可应用于在粘性末端或平末端连接双链DNA分子,也可应用于修补双链DNA、RNA或DNA RNA杂交体上的缺口。

T4DNA连接酶作用机制:分子生物学试验中主要采用T4DNA连接酶,因该酶在正常条件下,即能完成连接反应。T4 DNA连接酶是一单链多肽,分子量为68,000道尔顿,它能催化双链DNA上相邻的3ˊ羟基和5ˊ磷酸末断形成磷酸二脂键。λDNA用EcoRI酶切割后形成的6个片断均具有粘性末端(Cohesive ends),在T4 DNA连接酶作用下,可连接成原来的线状DNA。

T4-DNA连接酶即T4 DNA连接酶,可以催化粘端或平端双链DNA或RNA的5’-P末端和3’-OH末端之间以磷酸二酯键结合,该催化反应需ATP作为辅助因子T4 DNA Ligase即T4 DNA连接酶,可以催化粘端或平端双链DNA或RNA的5’-P末端和3’-OH末端之间以磷酸二酯键结合,该催化反应需ATP作为辅助因子。同时T4 DNA连接酶可以修补双链DNA、双链RNA或DNA/RNA杂合物上的单链缺口(single-strand nicks)。T4DNA连接酶在分子生物学中有广泛的应用。

T4DNA连接酶是经原核表达,柱层析纯化获得的高纯T4DNA接酶,SDS-PAGE显示为一条62kD的蛋白条带。本品附带10xLigationBuffer含有ATP。适用于DNA片断接、克隆等各种反应。连接条件:

推荐在10~20μl反应体系中进行接反应,反应中DNA浓度最大可达1mM(1kbDNA约1mg/ml)。首先混合要接的DNA片段,加入10×Ligase Buffer至终浓度为1×,再加入适量T4 DNA Ligase混匀。最适连接温度为16℃。粘末端连接效率较高,加入0.2~1μl T4 DNA Ligase,可在室温或16℃反应1~3小时完成反应;平末端连接效率较低,加入1μl T4 DNA Ligase,通常需要在16℃或4℃过夜完成反应。

注意事项:

1)10×LigaseBuffer含有ATP,使用前应在室温放置至融化或用手掌温度辅助融化,然后置于冰上。不要加热融化以免ATP降解。

2)T4 DNA Ligase对热敏感,容易失活。使用时请放置冰上,用后立即置冰箱中冷冻保存。

3)如需在接反应后灭活T4 DNA Ligase,可于65℃孵育10min即可。

4)10×LigaseBuffer不宜反复冻融,建议分装。

应用[7][8]

1.粘性末端或平末端双链DNA的连接;

2.双链寡核苷酸接头与双链DNA连接;

3.双链DNA、RNA或DNA-RNA复合体中缺口的修复;

4.连接酶介导的RNA检测;

5.位点特异性突变;扩增片段长度多态性。

DNA连接酶对单个核苷酸差异具有很强的鉴别能力,其核心在于它可以把与模板完全配对的两相邻寡核苷酸片段连接起来,如果连接处出现一个碱基错配,连接反应就不能进行。以该酶为基础的技术如空隙-连接酶链反应(gap ligase chain reaction,Gap-LCR)和连接酶检测反应(ligase detection reaction,LDR)在低丰度基因单核苷酸差异检测方面具有很强的应用潜力。

在妊娠过程中母体血浆中存在游离胎儿DNA,这一发现为基于母体外周血的无创性产前诊断开辟了新的领域。胎儿DNA一半来自于母亲,另一半来自于父亲,目前已报道利用母体血浆DNA来检测胎儿父系来源的致病基因,可应用于父亲为常染色体显性遗传病患者的胎儿无创性产前诊断,而且将这种检测方法应用于父亲为常染色体隐性遗传病携带者的产前诊断,也可使50%的胎儿避免了传统的绒毛吸取或羊膜腔穿刺检查。

但由于母体血浆总DNA量少,且在血浆总DNA中胎儿DNA所占的比例甚微,母体等位DNA片段可干扰胎儿DNA的检测,因此对这种低丰度胎儿DNA检测必须采用高灵敏度和高特异性的分析系统。点突变或单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)的检测是目前DNA分子诊断中的主要研究内容,对母体血浆中的这些单核苷酸差异的检测在技术上要求更高,目前所用的检测方法仍不够理想。DNA连接酶对单个核苷酸差异具有很强的鉴别能力,其核心在于它可以把与模板完全配对的两相邻寡核苷酸片段连接起来,如果连接处出现一个碱基错配,连接反应就不能进行。

参考文献

[1]Restriction endonuclease[J].Raymond J.Williams.Molecular Biotechnology.2003(3)

[2]Estrogen Receptor Alpha Gene Polymorphisms and Breast Cancer Risk[J].Aesun Shin,Daehee Kang,Hisahide Nishio,Myeong Jin Lee,Sue Kyung Park,Sook-Un Kim,Dong-Young Noh,Kuk-Jin Choe,Se-Hyun Ahn,Ari Hirvonen,Ju Han Kim,Keun-Young Yoo.Breast Cancer Research and Treatment.2003(1)

[3]Evaluation of bidirectional transfer of plasma DNA through placenta[J].Akihiko Sekizawa,Kaori Yokokawa,Yumi Sugito,Mariko Iwasaki,Yasuo Yukimoto,Kiyotake Ichizuka,Hiroshi Saito,Takashi Okai.Human Genetics.2003(4)

[4]Maternal serum cell-free fetal DNA levels are increased in cases of trisomy 13 but not trisomy 18[J].Tuangsit Wataganara,Erik S.LeShane,Antonio Farina,Geralyn M.Messerlian,Thomas Lee,Jacob A.Canick,Diana W.Bianchi.Human Genetics.2003(2)

[5]Fetal gender determination in early pregnancy through qualitative and quantitative analysis of fetal DNA in maternal serum[J].Hiroshi Honda,Norio Miharu,Yoko Ohashi,Osamu Samura,Masayuki Kinutani,Tetsuaki Hara,Koso Ohama.Human Genetics.2002(1)

[6]Birth of Healthy Children After Preimplantation Diagnosis of Thalassemias[J].A.Kuliev,S.Rechitsky,O.Verlinsky,V.Ivakhnenko,J.Cieslak,S.Evsikov,G.Wolf,M.Angastiniotis,G.Kalakoutis,C.Strom,Y.Verlinsky.Journal of Assisted Reproduction and Genetics.1999(4)

[7]Preimplantation Diagnosis of Thalassemias[J].A.Kuliev,S.Rechitsky,O.Verlinsky,V.Ivakhnenko,S.Evsikov,G.Wolf,M.Angastiniotis,D.Georghiou,V.Kukharenko,C.Strom,Y.Verlinsky.Journal of Assisted Reproduction and Genetics.1998(5)

[8]易萍.母体血浆中胎儿DNA点突变新型检测技术在无创性产前诊断中价值的研究[D].第三军医大学,2006.