毛蕊异黄酮苷的制备及提取

背景及概述^[1][2]

黄芪是一种常用中药，味甘、性温，具有益气养元、扶正祛邪、养心通脉、 健脾利湿的功效，可用于心气虚损、血脉瘀阻。在临床上，黄芪既可作为单独用药治疗该病，如黄芪注射液，也常与其它中药配伍复方应用，如芪冬颐心口服液。专利(专利号：ZL200510110641.3)报道了从黄芪中提取纯化制备有效成分毛蕊异黄酮-7-氧-β-D-吡喃葡萄糖苷(Calycosin-7-O-β-D-glucoside)，简称毛蕊异黄酮苷，经药理试验证明该化合物具有抑制柯萨奇病毒(Coxsackievirus)及治疗病毒性心肌炎。

制备^[1]

毛蕊异黄酮苷在药材中的含量很低。经对内蒙、甘肃、河北和山西等地产十四批黄芪药材的实际测定，其中的毛蕊异黄酮苷平均含量只有0.0327％(约万分之三)，最高0.0536％，最低仅为0.0116％。由此，进行毛蕊异黄酮苷的全合成，可以节约药材，降低用药成本。    

步骤一、黄酮S3(3’，7-二羟基-4’-甲氧基异黄酮)的制备

将间苯二酚3mmol和取代苯乙酸3mmol溶于新蒸的三氟化硼乙醚溶液 2mL中，加热至85～90℃，磁力搅拌6～10h(TLC显示原料基本消失)，冷却至10℃，逐滴滴加二甲基甲酰胺5mL，得混合物I.

Vilsmeyer-Haack试剂：将二甲基甲酰胺8.1mL冷却到10℃，分批加入五氯化磷5mmol，加热至55℃，磁力搅拌反应1h，得到淡红色或黄色混合物II。

室温下，30min内将混合物II分批加到混合物I中，室温搅拌3h后，将此反应液倒入甲醇化的盐酸(0.1mol/L)30mL中，加热至70℃，恒温50min，冷却静置。减压蒸馏后，用水150mL洗，然后用乙酸乙酯萃取150mL×3次，再用水洗150mL×2次，旋干乙酸乙酯(在大量制备时可考虑将乙酸乙酯萃取液过滤硅 藻土后再旋干，已除去一些不容物杂质)，用少量乙醇混悬沉淀溶解部分色素，离心过滤，取沉淀在氮气保护下用乙醇热重结晶。目前用硅胶柱以 MeOH:CH₂Cl₂＝1:35为展开剂分离，得产物1.6mmol，产率50％～60％。(GRACE VisionHT C18HL(250mm * 4.6mm，5um)，洗脱剂水/乙腈＝65：35，tR＝6.1min， 纯度92％(ELSD，归一化法))

¹HNMR(500MHz,DMSO)δ10.87(s,1H),9.08(s,1H),8.29(s,1H),7.97(d,J＝8.7Hz,1H), 7.05(s,1H),6.94(s,2H),6.87(s,1H),3.78(s,3H)。

¹³CNMR(126MHz,DMSO)δ174.8,162.5,157.5,153.3,147.6,146.0,127.5, 124.8,123.5, 119.9,116.8,116.4,115.2,112.0,102.2,55.7。

HRMS(ESI):m/z[M-H]^-calcd forC16H11O5^-：283.0612；found：283.0607。

步骤二、S4(3’,7-二乙酰氧基-4’-甲氧基异黄酮)的制备

在0℃下用无水二氯甲烷900mL溶解毛蕊异黄酮苷元7mmol，加入乙酸酐7 mL并滴加三乙胺10mL，反应12h并逐渐升至室温。反应结束后，加入水1000mL 淬灭反应。分离有机相，水相用二氯甲烷900mL萃取，合并有机相并用无水 Na2SO4干燥，减压旋出溶剂。用少量乙醇或乙酸乙酯洗去色素，得白色产物6 mmol，产率90～95％。

步骤三、S5(7-羟基-3’-乙酰氧基-4’-甲氧基异黄酮)的制备

室温将7,3’-二乙酰氧基毛蕊异黄酮0.35mmol用DCM/MeOH(1:1)3ml溶解， 冰浴下加入无水K₂CO₃0.05mmol，慢慢升至室温反应8h。用6％盐酸滴加至中性，加入乙酸乙酯萃取，水洗，无水Na₂SO₄干燥，减压旋出溶剂，硅胶柱层析，可得目标化合物，产率40～50％。

(GRACE VisionHT C18HL(250mm x 4.6mm,5um)，洗脱剂水/乙腈 ＝60:40，tR＝7.9min，纯度98％(ELSD，归一化法))

¹HNMR(500MHz,DMSO)δ10.84(s,1H),8.39(s,1H),7.97(d,J＝8.8Hz,1H),7.47(dd,J＝8.5,2.1Hz,1H),7.36(d,J＝2.1Hz,1H),7.18(d,J＝8.6Hz,1H),6.95(dd,J＝8.8,2.2Hz, 1H),6.88(d,J＝2.1Hz,1H),3.80(s,3H),2.27(s,3H)。

¹³CNMR(126MHz,DMSO)δ174.41,168.49,162.69,157.42,153.59,150.56,138.87, 127.30,127.17,124.54,123.20,122.18,116.55,115.30,112.49,102.16,55.90,20.41。

HRMS(ESI)：m/z[M-H]^-calcd for C18H13O6^-：325.0718；found： 325.0750。

步骤四、S6(3’-乙酰氧基-4’-甲氧基异黄酮-7-O-β-D-四乙酰氧基葡萄糖苷)的制备

将3’-乙酰氧基毛蕊异黄酮120mg、四正丁基溴化铵16.7mg和2，3，4，6- 四乙酰氧基-α-D-溴代吡喃葡萄糖410mg，溶解于DMF/丙酮(1:1)30mL中，加入 K₂CO₃ 1.45g，在氮气保护下，室温反应24h。旋干有机相，水相用CH₂Cl₂90mL x 2次萃取，合并有机相并用无水Na₂SO₄干燥，减压旋出溶剂。硅胶柱层析，可 得目标化合物，产率50～60％。

步骤五、最终产物毛蕊异黄酮苷(毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷)的合成

将3’-乙酰氧基-7-O-β-D-四乙酰基葡萄糖毛蕊异黄酮苷2mmol溶解于甲醇 15mL，冰水冷却至0℃后，加入新制备的0.1mol/L甲醇钠的甲醇溶液15mL， 保持0℃下继续搅拌2h。反应结束后，加入适量的732阳离子交换树脂中和，过滤，滤液经减压蒸馏后得到粗品。用少量甲醇洗去色素，得白色产物1.9mmol，产率85～95％。(GRACE VisionHT C18HL(250mm x 4.6mm,5um)，洗脱剂水/乙腈＝80：20，tR＝6.1min，纯度97％(ELSD，归一化法))

¹HNMR(500 MHz,DMSO)δ9.03(s,1H),8.39(s,1H),8.05(d,J＝8.9 Hz,1H), 7.23(d,J＝2.2Hz,1H),7.15(dd,J＝8.9,2.2 Hz,1H),7.07(s,1H),6.97(s,2H),5.45(d,J＝4.6 Hz,1H), 5.16(d,J＝4.4 Hz,1H),5.11(d,J＝7.3 Hz,1H),5.09(d,J＝5.3 Hz,1H),4.62(t,J＝5.4 Hz,1H),3.79(s,3H),3.77-3.12(m,6H)。

¹³CNMR(126MHz,DMSO)δ174.7,161.4,157.0,153.6,147.6,146.1,127.0, 124.5,123.6, 119.7,118.5,116.4,115.6,112.0,103.4,100.0,77.2,76.5,73.2,69.6, 60.7,55.7。

HRMS(ESI)：m/z[M-H]^-calcd for C22H21O10^-：445.1140；found：445.1111。

提取^[2]

黄芪中毛蕊异黄酮苷的提取与纯化方法，包括以下步骤：

(1)称取黄芪药材粉末，按每10公斤粉末加入100L的体积浓度为70‑85％乙醇提取，过滤，滤液浓缩至无醇味，过大孔树脂，先用蒸馏水水洗至澄清，再用体积浓度为70‑85％ 的乙醇洗脱，收集含毛蕊异黄酮苷的组份，回收乙醇，在水浴锅上浓缩得浸膏；

(2)称取浸膏，用适量甲醇溶解后加入100‑200目的硅胶拌样进行硅胶柱层析，采 用体积比为9∶1∶0.05的氯仿‑甲醇‑水溶液洗脱，收集样品，点板，合并含有毛蕊异黄酮苷 斑点的组分，再将其蒸干；

(3)用适量甲醇溶解后再加入100‑200目的硅胶拌样进行硅胶柱层析，采用体积比 为9∶1∶0.05的氯仿‑甲醇‑水溶液洗脱，收集样品，点板，合并含有毛蕊异黄酮苷斑点的组分，蒸干得毛蕊异黄酮苷化合物粗品；

(4)粗品用适量甲醇溶解后加入2倍甲醇体积的石油醚萃取，弃去石油醚层，甲醇层有白色沉淀析出，过滤，滤渣依次用石油醚、甲醇洗涤，得米白色沉淀；

(5)米白色沉淀再经100‑200目的硅胶拌样进行硅胶柱层析，采用体积比为9∶1∶0.05 的氯仿‑甲醇‑水溶液洗脱，收集样品，合并含有毛蕊异黄酮苷的组份，用甲醇重结晶，得到纯的毛蕊异黄酮苷，挥干，保存。

采用本发明方法可制取中药材对照品黄芪毛蕊异黄酮苷，而且效率高、成本低。

药理作用^[3]

毛蕊异黄酮苷是中药黄芪的活性成分，属于黄酮类化合物。有研究报道低浓度的毛蕊异黄酮(2、4和8μmol/L)促进MCF-7细胞增殖，高浓度毛蕊异黄酮(16和32μmol/L) 抑制MCF-7细胞增殖，并且呈剂量依赖性；同时，低浓度的毛蕊异黄酮能减少MCF-7 细胞凋亡率；另有研究显示，毛蕊异黄酮对K562细胞有明显的抑制作用，业内认为，将细胞生长周期阻滞在G0/G1期以及降低细胞内Cyclin D1 mRNA水平可能是其抑制 K562细胞生长的主要作用机制；另有研究显示，毛蕊异黄酮可以抑制TGF-β1诱导的内皮细胞(ECV-304)向肌成纤维细胞转化，具有保护内皮细胞的作用。CN201510644043.8报道了毛蕊异黄酮苷通过降低哮喘小鼠气道高反应性，抑制气道炎症，抑制免疫性炎症相关趋化因子，调节T细胞亚型及相关细胞因子分泌，抑制NF-κB通路发挥抗哮喘作用，

主要参考资料

[1] CN201510821795.7 一种化学合成毛蕊异黄酮苷的方法

[2] CN201110452437.5黄芪中毛蕊异黄酮苷的提取与纯化方法

[3] CN201510644043.8 毛蕊异黄酮苷在制备哮喘药物中的用途