热敏UDG酶的应用

背景^[1]

热敏型尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)是来源于嗜冷海洋细菌经大肠杆菌表达纯化的的重组蛋白，又称南极热敏UDG。该UDG酶能有效地水解单链或双链 DNA 上的尿嘧啶，产生的缺嘧啶位点，在高温或高 pH 下，极易水解断裂。该酶对RNA无活性，主要用于PCR扩增产物的防污染。大肠杆菌来源的尿嘧啶-DNA 糖基化酶较为耐热，经95℃10min处理仍会残留有少量的尿嘧啶-DNA 糖基化酶活性，导致含有dU碱基的PCR产物的降解。

而来源于嗜冷海洋细菌的热敏型UDG在50℃ 5min即完全失活，在进行PCR扩增前，在PCR混合液中添加尿嘧啶-DNA 糖基化酶（热敏性），25℃10min即可消除PCR产物的残留污染，由于尿嘧啶-DNA 糖基化酶（热敏性）在PCR循环的94℃变性一步便可被灭活，因此不会影响新的含dU的PCR产物。

应用^[1]

尿嘧啶糖基化酶在D P 防污染中的应用

热敏型尿嘧啶-DNA糖基化酶可用于去除单链或双链DNA中的尿嘧啶碱基，也可以去除 PCR 残存污染。在PCR 操作过程中，最容易出现污染” 问题，原因主要有如下几种情况：

①模板的交叉污染：在样品采集或处理中，气溶胶、加样器取样时的泡沫或其他原因引起样品或模板的交叉污染，造成假阳性，属于正常DNA 由A、T、G、C 四种碱基组成引起的污染；

② 扩增产物的污染：在扩增过程中，将碱基T 置换成U，使得扩增产物为U-DNA (由A、U、G、C四种碱基组成)，由于产物量特别大，容易溢漏引起污染，造成假阳性；

③ 核酸酶、蛋白酶的污染造成假阴性；在这三种情况中最为严重是第二种，即称之为“ 残留污染” ，因为PCR 扩增的放大倍数高达千万倍，而且在实际应用中扩增一直在反复进行，造成扩增产物的大量堆积，难于将其控制降解，即使是荧光PCR 也很难避免扩增产物的污染，为了使得PCR 结果更加可靠、准确，有必要在反应管完全封闭后于管内通过酶或其他方法，将操作过程中可能带人的残留污染物破坏，使其不能成为新一轮扩增的模板，从UDG 的生物学性质可知，它是完成这一任务的选择。

从生物学特性来看，UDG 是一种常见的DNA 修复酶之一，具有DNA 糖苷酶的一般特性—不依赖镁离子、球蛋白、分子量小，能够特异地作用于DNA 分子中的尿嘧啶残基，不能作用于游离的尿嘧啶核苷、RNA 和四种正常的核苷酸等，在DNA 修复中起重要作用。

作用原理^[1]

大肠杆菌热敏尿嘧啶DNA糖基化酶( UDG 也有些文章简写为UNG ) 是PCR 防污染应用最广泛的酶之一，由UNG基因编码；该基因位于染色体5 分钟处，全基因长750bP，含有一个ORF，其长度为678b p，编码229 个氨基酸，理论蛋白质分子量为25，66 4Da；PCR 防污染正是利用了UDG在DNA 修复过程中的生物学特性，下面是UDG 作用于含尿啥吮的DNA ( U-DNA ) 的化学图解(图1) 和P CR 防污染的示意图(2)：

由图一可以看出，在适宜的条件下，UDG 能特异地识别DNA 分子中出现的鸟嘧啶核苷，并将其切割下来，形成自由的尿嘧啶，在DNA 除去尿嘧啶的部位留下“糖一磷酸骨架” 完整的无碱基“空洞”即脱嘌呤嘧啶位点，在加热或碱性条件下，DNA 在“ 糖一磷酸骨架”处断裂，这就是UDG 水解含尿唠吮DNA 的化学原理。

在图二中首先可以看到，由正常碱基A、T、G、C 构成的正常DNA，可以通过PCR 反应，用dUTP 代替传统的d竹P 扩增出大量含有尿嚓吮的DNA ( U-DNA )，是热敏尿嘧啶-DNA糖基化酶的有效底物；当扩增产物作为“残留污染物”时，它能通过UDG 的水解作用产生脱嘧啶嘌呤位点，该位点当进行PCR 预变性时DNA 链在这些位点发生断裂，失去模板的功能，同时，通过预变性能够将反应体系中的UDG 灭活，一方面有效的防止了“ 残留污染物”对PCR 反应带来的污染，达到预防污染的目的，另一方面又有效地保护了新生扩增产物，完成新的PCR 扩增。

主要参考资料

[1] 李振勇, 刘明霞. 尿嘧啶 DNA 糖基化酶在 PCR 防污染中的应用[J]. 中国医药导刊, 2001, 3(4): 305-306.