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热敏UDG酶的应用

发布日期:2018/12/6 13:48:52

背景[1]

热敏型尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)是来源于嗜冷海洋细菌经大肠杆菌表达纯化的的重组蛋白,又称南极热敏UDG。该UDG酶能有效地水解单链或双链 DNA 上的尿嘧啶,产生的缺嘧啶位点,在高温或高 pH 下,极易水解断裂。该酶对RNA无活性,主要用于PCR扩增产物的防污染。大肠杆菌来源的尿嘧啶-DNA 糖基化酶较为耐热,经95℃10min处理仍会残留有少量的尿嘧啶-DNA 糖基化酶活性,导致含有dU碱基的PCR产物的降解。

而来源于嗜冷海洋细菌的热敏型UDG在50℃ 5min即完全失活,在进行PCR扩增前,在PCR混合液中添加尿嘧啶-DNA 糖基化酶(热敏性),25℃10min即可消除PCR产物的残留污染,由于尿嘧啶-DNA 糖基化酶(热敏性)在PCR循环的94℃变性一步便可被灭活,因此不会影响新的含dU的PCR产物。

应用[1]

尿嘧啶糖基化酶在D P 防污染中的应用

热敏型尿嘧啶-DNA糖基化酶可用于去除单链或双链DNA中的尿嘧啶碱基,也可以去除 PCR 残存污染。在PCR 操作过程中,最容易出现污染” 问题,原因主要有如下几种情况:

①模板的交叉污染:在样品采集或处理中,气溶胶、加样器取样时的泡沫或其他原因引起样品或模板的交叉污染,造成假阳性,属于正常DNA 由A、T、G、C 四种碱基组成引起的污染;

② 扩增产物的污染:在扩增过程中,将碱基T 置换成U,使得扩增产物为U-DNA (由A、U、G、C四种碱基组成),由于产物量特别大,容易溢漏引起污染,造成假阳性;

③ 核酸酶、蛋白酶的污染造成假阴性;在这三种情况中最为严重是第二种,即称之为“ 残留污染” ,因为PCR 扩增的放大倍数高达千万倍,而且在实际应用中扩增一直在反复进行,造成扩增产物的大量堆积,难于将其控制降解,即使是荧光PCR 也很难避免扩增产物的污染,为了使得PCR 结果更加可靠、准确,有必要在反应管完全封闭后于管内通过酶或其他方法,将操作过程中可能带人的残留污染物破坏,使其不能成为新一轮扩增的模板,从UDG 的生物学性质可知,它是完成这一任务的最佳选择。

从生物学特性来看,UDG 是一种常见的DNA 修复酶之一,具有DNA 糖苷酶的一般特性—不依赖镁离子、球蛋白、分子量小,能够特异地作用于DNA 分子中的尿嘧啶残基,不能作用于游离的尿嘧啶核苷、RNA 和四种正常的核苷酸等,在DNA 修复中起重要作用。

作用原理[1]

大肠杆菌热敏尿嘧啶DNA糖基化酶( UDG 也有些文章简写为UNG ) 是PCR 防污染应用最广泛的酶之一,由UNG基因编码;该基因位于染色体5 分钟处,全基因长750bP,含有一个ORF,其长度为678b p,编码229 个氨基酸,理论蛋白质分子量为25,66 4Da;PCR 防污染正是利用了UDG在DNA 修复过程中的生物学特性,下面是UDG 作用于含尿啥吮的DNA ( U-DNA ) 的化学图解(图1) 和P CR 防污染的示意图(2):

由图一可以看出,在适宜的条件下,UDG 能特异地识别DNA 分子中出现的鸟嘧啶核苷,并将其切割下来,形成自由的尿嘧啶,在DNA 除去尿嘧啶的部位留下“糖一磷酸骨架” 完整的无碱基“空洞”即脱嘌呤嘧啶位点,在加热或碱性条件下,DNA 在“ 糖一磷酸骨架”处断裂,这就是UDG 水解含尿唠吮DNA 的化学原理。

在图二中首先可以看到,由正常碱基A、T、G、C 构成的正常DNA,可以通过PCR 反应,用dUTP 代替传统的d竹P 扩增出大量含有尿嚓吮的DNA ( U-DNA ),是热敏尿嘧啶-DNA糖基化酶的有效底物;当扩增产物作为“残留污染物”时,它能通过UDG 的水解作用产生脱嘧啶嘌呤位点,该位点当进行PCR 预变性时DNA 链在这些位点发生断裂,失去模板的功能,同时,通过预变性能够将反应体系中的UDG 灭活,一方面有效的防止了“ 残留污染物”对PCR 反应带来的污染,达到预防污染的目的,另一方面又有效地保护了新生扩增产物,完成新的PCR 扩增。

主要参考资料

[1] 李振勇, 刘明霞. 尿嘧啶 DNA 糖基化酶在 PCR 防污染中的应用[J]. 中国医药导刊, 2001, 3(4): 305-306.