植物线粒体膜蛋白提取试剂盒的应用

背景^[1-3]

植物线粒体膜蛋白提取试剂盒可用于从植物叶片组织中分离出完整而纯化的线粒体。适合于田间采摘或者实验室培养的植物叶片中线粒体的制备。其制备物，可以被用于细胞凋亡、信号传递、代谢和蛋白组学等的研究。但不适用于进一步DNA提取。

植物线粒体膜蛋白胶图

操作步骤

1.样本采集前处理：无论田间自然生长还是实验室组织培养，采摘前须避光生长24-48小时，以减少叶片组织中糖类及叶绿体含量。取适量Lysis Buffer，加入0.5%β-巯基乙醇，10ml Lysis Buffer加入50ulβ-巯基乙醇，混匀，形成Lysis Buffer/β-巯基乙醇溶液，此溶液可2-8度保存一个月。

2.叶片用蒸馏水清洗2-3次，滤纸吸干，有条件请用液氮研磨叶片1-2克，研磨完后，取800mg左右研磨的叶片粉，加入1.5ml预冷的Lysis Buffer/β-巯基乙醇溶液，混匀。如果无条件（无液氮），请预冷研钵，取洗过的叶片1000 mg，用剪刀剪为碎块放入玻璃匀浆器或者研钵中。加入1.5ml预冷的Lysis Buffer/β-巯基乙醇溶液，冰上研磨至看不见明显组织块；

3.将研磨物放置合适的离心管，4℃，1000×g离心5 min；

4.将上清转移到一新的离心管中，在沉淀中加入0.5ml Lysis Buffer/β-巯基乙醇溶液，混匀，再次4℃，1000×g离心5 min，取上清；合并两次上清，将上清4℃1000×g再次离心5 min。

5．取上清，加入一新的离心管中，4℃，16,000×g离心10 min。离心后的上清含胞浆成分，可从中提取胞浆蛋白。将上清转移到新离心管，线粒体沉淀在管底。

6.在线粒体沉淀中加入0.5 mL Wash Buffer重悬线粒体沉淀，4℃，1000×g离心5 min；

7．取上清，加入一新的离心管中，4℃，16,000×g离心10 min。弃上清，高纯度的线粒体沉淀在管底；

8.用50-100μL Store Buffer或合适的反应缓冲液重悬线粒体沉淀，立即使用或-70℃保存。

应用^[4][5]

用于红莲型细胞质雄性不育水稻线粒体蛋白质组学分析研究

采用差速离心配合Percoll梯度离心技术,从不育系粤泰A（Yuetai A,YtA）及其保持系粤泰B（Yuetai B,YtB）黄化苗中纯化得到线粒体。利用双甲基化标签质谱定量技术,比较研究了二者线粒体总蛋白质组的差异。并且配合蓝绿胶电泳技术（Blue native polyacrylamide gel electrophoresis,BN-PAGE）及2D BN/Tricine-SDS PAGE.比较研究了线粒体蛋白质复合体亚基组成和含量的差异。

线粒体蛋白质组学分析共鉴定得到216个水稻线粒体蛋白,其中208个蛋白为线粒体总蛋白,91个蛋白为参与复合体组装的蛋白,83个蛋白同时包含上述二者定量信息。216个线粒体蛋白依功能可分为12类,覆盖绝大部分线粒体功能。

肽段数目和BN组分关联分析显示参与同一复合体组装的亚基在BN胶中呈现聚合效应,说明BN胶内蛋白定量信息能间接反映复合体定量信息。

深入分析不育系和可育系线粒体总蛋白与复合体的定量信息,发现不育系线粒体内大部分蛋白的总含量上升,这些蛋白实际参与复合体组装的含量却低于可育系,其中负责氧化磷酸化的复合体Ⅰ和复合体V表现得尤为典型,说明不育系中复合体组装过程存在缺陷。

不育系线粒体中大量氧自由基（Reactive oxygen species,ROS）及胁迫响应相关蛋白普遍上调,从蛋白水平应证了不育系受到严重的氧化胁迫,认为氧化胁迫导致不育系中线粒体蛋白氧化受损,进而影响复合体组装。

线粒体总蛋白质组学分析发现,大部分线粒体蛋白变化在2倍以内,然而有4个蛋白在不育系中上调2倍以上,其中2个为花穗性决定类似蛋白（sex determination TASSELSEED2like protein,TS2）（Os07g46920.1,Os07g40250.1）,它们上调达到4到6倍。

参考文献

[1]The mitochondrial gene orfH79 plays a critical role in impairing both male gametophyte development and root growth in CMS-Honglian rice[J].Peng Xiaojue,Wang Kun,Hu Chaofeng,Zhu Youlin,Wang Ting,Yang Jing,Tong Jiping,Li Shaoqing,Zhu Yingguo.BMC Plant Biology.2010(1)

[2]Internal Architecture of Mitochondrial Complex I from Arabidopsis thaliana[J].Klodmann,Jennifer,Sunderhaus,Stephanie,Nimtz,Manfred,Jnsch,Lothar,Braun,Hans-Peter.Plant Cell.2010(3)

[3]Proteome analysis of the normal and Ogura（ogu）CMS anthers of Brassica napus to identify proteins associated with male sterility[J].Sheoran,Inder S.,Sawhney,Vipen K..Botany.2010(3)

[4]Quantitative Proteomic Analysis of CMS-Related Changes in Honglian CMS Rice Anther[J].Qingping Sun,Chaofeng Hu,Jun Hu,Shaoqing Li,Yingguo Zhu.The Protein Journal.2009(7-8)

[5]刘盖.红莲型细胞质雄性不育水稻线粒体蛋白质组学分析[D].武汉大学,2011.