细菌基因组DNA快速提取试剂盒(带蛋白酶K)的应用

背景^[1-3]

细菌基因组DNA快速提取试剂盒(带蛋白酶K)用于细菌基因组DNA的小量提取。其纯化原理是利用细胞裂解液裂解细胞释放基因组DNA，由硅胶膜柱可逆吸附基因组DNA，经蛋白酶消化、漂洗液清洗除去蛋白质、脂质等杂质后，用纯化液洗脱获得基因组DNA。本产品可从0.5-2 ml对数生长期的菌液（不超过106–108个）中提取到3-20μg超纯基因组DNA（OD260/280=1.7-1.9），此基因组DNA可直接用于酶切、PCR等后续实验。

细菌DNA琼脂糖胶图

操作方法

1取0.5-2 ml处于对数生长期菌液，置于1.5 ml离心管中。12,000 rpm离心1min，弃上清。

2向收集到的菌体沉淀中加入200μl缓冲液DS，用漩涡振荡器剧烈振荡直至菌体彻底悬浮。

3加入20μl蛋白酶K溶液，混匀。

4加入220μl裂解液MS，漩涡振荡混匀，直至形成均一的悬浮液。65℃温浴10min。溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

5加入220μl无水乙醇，上下颠倒混匀。此时可能出现絮状沉淀，将溶液及絮状沉淀转移到纯化柱中。12,000 rpm离心1min，弃滤液。

6加入500μl去蛋白液PS。12,000 rpm离心1min，弃滤液。

7加入500μl漂洗液PE。12,000 rpm离心1min，弃滤液。

8加入500μl漂洗液PE。12,000 rpm离心1min，弃滤液。

9 12,000 rpm离心3min，以彻底去除纯化柱中残留的液体。

10将纯化柱置于新的1.5 ml离心管中。向纯化柱中央处，悬空加入30-100μl洗脱液TE。室温放置2min。于12,000 rpm离心2min，管底即为高纯度基因组DNA。-20℃保存。

应用^[4][5]

用于金磁微粒纯化细菌基因组DNA方法的研究

磁性复合粒子特有的超顺磁性使其在外加磁场中反复操作而不聚集,较大的比表面积又保证了生物分子在其表面的固定化容量,与传统的液相和离心柱式固相纯化核酸纯化方法相比,基于磁性复合微粒的核酸纯化法具有更多的优势,如纯化过程简便快速、无需离心操作、不涉及有毒污染试剂,可适于大规模自动化工作站使用等,将成为未来核酸纯化的主导发展方向。

以金磁微粒（GoldMag（R）particles）为载体,对细菌基因组DNA的纯化方法进行了探讨。采用简单的氯化钠／乙醇结合体系,建立了从革兰氏阴性菌中纯化基因组DNA的方法。

分别以大肠杆菌和铜绿假单胞菌为样本,对纯化方法进行评价；并将该法与商品化试剂盒进行比较,纯化得到的基因组DNA可成功用于PCR扩增等下游应用。

实验结果表明：该方法可从500μl大肠杆菌培养液（OD600=3.0）中纯化得到约20μg的基因组DNA,产率约是商品化试剂盒TIANamp Bacteria DNA Kit的3倍,其OD260/OD280比值在1.7-1.9之间,能够满足下游PCR反应的要求。

以DNA产率为指标,纯化大肠杆菌基因组DNA的平均批内差为3.98%、批间差为8.41%,纯化铜绿假单胞菌基因组DNA的平均批内差为7.32%、批间差为10.67%。方法具有较好的稳定性和重复性。

以枯草芽孢杆菌为样本,初步探索了从革兰氏阳性菌中纯化基因组DNA的方法,对溶菌酶用量、RNase用量和样本处理方式进行了优化,结果表明：方法可从500μl枯草芽孢杆菌培养液（OD600=3.0）中纯化得到2-4μg的基因组DNA,其OD260/OD280比值在1.7-1.9之间,并能满足下游PCR实验扩增要求。

参考文献

[1]DNA,RNA,and Protein Extraction:The Past and The Present[J].Siun Chee Tan,Beow Chin Yiap,Joakim Lundeberg.Journal of Biomedicine and Biotechnology.2009

[2]Extraction of PCR-ready DNA from Staphylococcus aureus bacteriophages using carboxyl functionalized magnetic nonporous microspheres[J].Journal of Chromatography B.2009(7)

[3]Specific magnetic bead-based capture of free fetal DNA from maternal plasma[J].Transfusion and Apheresis Science.2009(3)

[4]Bacteria capture,lysate clearance,and plasmid DNA extraction using pH-sensitive multifunctional magnetic nanoparticles[J].Zhi Shan,Qi Wu,Xianxiang Wang,Zhongwu Zhou,Ken D.Oakes,Xu Zhang,Qianming Huang,Wanshen Yang.Analytical Biochemistry.2009(1)

[5]张景阁.金磁微粒纯化细菌基因组DNA方法的研究[D].西北大学,2011.