脂肪酶的制备方法

发布日期:2021/1/29 17:10:44

背景及概述^[1]

脂肪酶，全称为三酰基甘油水解酶，它能够在脂-水界面上催化酯键水解，可以催化三酰甘油酯及其它一些水不溶性酯类的水解、醇解、酯化、转酯化及酯类的逆向合成反应。脂肪酶广泛存在动植物和微生物中，由于微生物种类多、分布广、适应性强、进化快，在微生物中的脂肪酶往往具有比动植物来源的脂肪酶具有更广的作用温度、pH和底物特异性等优势。微生物是工业用脂肪酶的主要来源。

脂肪酶在工业生产中被广泛应用。如在食品工业中脂肪酶被用于肉类脱脂、面粉改良、油脂改性、奶酪加工、酿酒和酱料加工。在饲料工业中，脂肪酶与其他碳水化合物降解酶复配成复合酶作为饲料添加剂，可以有效提高饲料利用率。脂肪酶还被广泛应用于医药和精细化工工业中的手性化合物的生物拆分。在造纸工业中，脂肪酶可以实现木浆中松脂的酶法去除。在生物柴油工业中，脂肪酶可以用于催化油脂与断链醇的酯交换反应，用于酶法合成生物柴油。在洗涤工业、皮革加工和纺织工业中脂肪酶也被大量应用。

制备^[1-2]

报道一、

将油体蛋白、蛋白连接肽与脂肪酶依次连接构成重组脂肪酶，然后将重组脂肪酶转化水稻，获得含有重组脂肪酶基因的水稻种子，将所述的水稻种子脱壳匀浆，再在匀浆液中加入油脂，收集油层，获得脂肪酶提取液。

报道二、

一种采用固定化马抗体提取纯化脂肪酶的方法，包括步骤：

S1：将产脂肪酶的假单胞菌ATCC 21808的单一菌落置于装有25mL摇瓶培养液的250mL摇瓶中，在28℃、200rpm条件下培养20h，然后按10％的接种量转入发酵培养液中，在28℃、200rpm条件下培养68h，得到发酵液；其中，每升摇瓶培养液中包括：酵母提取物5g、蛋白胨5g、植物油10g，余量为水；pH值为7.0；每升发酵培养液中包括：酵母提取物10g、蛋白胨5g、NaCl 0.5g、植物油10g，余量为水；pH值为7.0；

S2：将发酵液离心，收集上清液，得到脂肪酶粗酶液；其中，离心是采用高速冷冻离心机，在4℃、10800g条件下离心15min；

S3：将脂肪酶粗酶液上固定化马抗体柱，上柱期间，检测流出液的脂肪酶活性，直到有脂肪酶活性流出，停止上液；之后用pH值为7.2的0.1M的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液洗柱，再采用pH值为3的0.1M磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液洗脱，收集洗脱液，得到纯化后的脂肪酶；并且待酶流出后，立即用pH值为8的1M的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液洗柱至中性，也用该溶液调洗脱液至pH值至7；其中，固定化马抗体柱的制备方法包括步骤：选4匹蒙古马(重量和对应的年龄分别为：重量为240公斤且年龄为3岁、重量为290公斤且年龄为5岁、重量为320公斤且年龄为7岁、重量为360公斤且年龄为10岁)，每两周免疫一次，共进行12周的免疫，每次2mL，剂量分别为15mg脂肪酶加等量的弗氏完全佐剂，多点皮下免疫，ELISA检测抗体滴度大于1：10000后收集抗血清；将抗血清离心除去细胞成分和其他沉淀物，收集上清液后采用proteinA或proteinG亲和层析柱纯化出多克隆抗体；将多克隆抗体与活化的Sepharose2B连接，得到固定化马抗体柱；

S4：在纯化后的脂肪酶中加入聚乙二醇，使脂肪酶沉淀；之后离心，收集沉淀；将沉淀透析后冻干干燥，得到脂肪酶，酶活经测定达15-25万单位/克；其中，离心是在4℃、000g条件下离心8min。