溶菌酶的多种提取方法

【背景及概述】^{[1] [2][3]}

对微生物产生溶菌酶的研究，最早可追溯于Nicoile 1907 年发表枯草芽孢杆菌溶解因子的报告开始。从20 世纪中期以来，研究较多的有拟内串生孢霉(Chalarosis)、球孢链霉菌(S trep tomy ces globisporus)、灰色链霉菌(S trep tomy ces griseus)、蜡状芽孢杆菌(Baci lus cereus)、丙酮丁酸梭菌(Clostrid iumacetobuty l icum)、乳酸乳球菌(Lactococcus lacti s)、肺炎链球菌(S .pneumoniae)以及几种细菌噬菌体等产生的溶菌酶，日本和德国在微生物溶菌酶的研究较多，国内山东大学微生物国家重点实验室在这方面做了较多工作。对溶菌酶的研究始于20世纪初，人们发现人的唾液、眼泪中存在有溶解细菌细胞壁的酶，因其具有溶菌作用，故命名为溶菌酶。1937年Abraham和Robinson从卵蛋白中分离出溶菌酶晶体，揭开了研究溶菌酶的历史篇章。它广泛存在于鸟类、家禽的蛋清中和哺乳动物的泪液、唾液、血浆、乳汁、胎盘以及体液、组织细胞内，其中在蛋清中含量最丰富。在一些植物体如卷心菜、萝卜、无花果和微生物体内也存在溶菌酶，只是含量差异较大。

最新研究表明将溶菌酶固定化在食品包装材料上，生产出有抗菌功效的食品包装材料，以达到抗菌保鲜功能；将溶菌酶固定化在HEPA上，作为空调的空气净化系统，使其具有高效除尘和杀菌两大功能。当空气通过滤网时，先滤集捕捉尘粒和细菌，然后将捕捉到的细菌杀灭；用溶菌酶非专一性地降解海洋生物高分子壳聚糖，使其成为能被人体吸收的低分子量具有独特生理活性和功能性质的低聚壳聚糖。

【理化性质与结构】^[2][3]

溶菌酶(Lysozyme)是水解酶的一种，又称为胞壁质酶(muramidase)或N-乙酰胞壁质肽聚糖水解酶(Nacetylmuramideglycanohydrlase)。溶菌酶是一种碱性蛋白质，在酸性环境下，溶菌酶对热的稳定性很强，pH值3.0时96℃加热处理15min仍能保持87%的酶活性。在自然条件下，大多数溶菌酶化学性质稳定，即使当pH值在1.2～11.3范围内剧烈变化，其酶结构仍维持不变，活性也不受影响。但碱很容易使酶活性遭到破坏，当处于碱性pH值范围时，溶菌酶的热稳定性就很差。溶菌酶在干燥条件下，室温可长期保存，其纯品为白色或微黄色结晶体或无定型粉末，无嗅，味甜，易溶于水，不溶于丙酮、乙醚。其分子结构如下：

【分类】^[2]

溶菌酶的底物特异性很强，不同来源溶菌酶作用的底物不同。按溶菌酶的来源可分为蛋清溶菌酶、动物溶菌酶、植物溶菌酶、微生物溶菌酶和细菌噬菌体溶菌酶按作用细胞壁不同分为细菌细胞壁溶菌酶和真菌细胞壁溶菌酶。细菌细胞壁溶菌酶又细分为两种，一种是作用于β -1，4糖苷键的细胞壁溶解酶，另一种是作用于肽链尾端和酰胺部分的细胞壁溶解酶。真菌细胞壁溶菌酶包括酵母菌细胞壁溶解酶和霉菌细胞壁溶解酶。溶菌酶大体分为5种：(1)内N-乙酰己糖胺酶，此酶同于鸡蛋清溶菌酶，破坏细菌细胞壁肽聚糖中的β -1.4 糖苷键。(2)酰胺酶，切断细菌细胞壁肽聚糖中N-乙酰氨基葡萄糖胺与肽尾之间的N-乙酰胞壁酸-L-丙氨酸键。(3)内肽酶，使肽尾及肽桥内的肽键断裂。(4)β -1.3、β -1.6葡聚糖酶和甘露聚糖酶，此酶分解酵母细胞的细胞壁。(5)壳多糖酶，这是分解霉菌细胞壁的一种溶菌

【适应症】^[4]

溶菌酶临床用于慢性鼻炎、急慢性咽喉炎、口腔溃疡、水痘、带状疱疹、扁平疣、哮喘性气管炎、支气管哮喘、溃疡性结肠炎、腮腺炎等。

【规格及用量】 ^[4]

1. 肠溶片：10mg。口服，每日3次，每次3～5片。治疗水痘，10mg/(kg·d)，分3～4次服。

2. 口含片：每片20mg，每日4～6次，每次 1片。

3. 外用，用生理盐水或注射用水或甘油配成1%～2%溶液外擦，或直接喷撒药粉。

【药理作用】

溶菌酶系从鲜鸡蛋清中提取的一种能分解粘多糖的多肽酶。能使各种微生物细胞壁中的不溶性粘多糖类转变为可溶性粘肽类而发挥抗菌作用，在细胞内对被吞噬的病原菌起破坏作用。具有抗菌、抗病毒、止血消肿、清除局部坏死组织、痰液变稀、加强组织功能恢复等作用。

【注意事项】^[4]

肌注可发生过敏反应而致死，3岁以下小儿较易出现，故一般不采用注射给药。溶液宜新鲜配制。口服偶有过敏。

【其他应用】^[2]

1. 在食品工业中的应用

溶菌酶是一种无毒、无副作用的蛋白质，又具有溶菌作用，因此可用作食品防腐剂。目前已广泛应用于水产品、肉食品、蛋糕、清酒、料酒及饮料中的防腐，溶菌酶属于冷杀菌，在杀菌防腐过程中不需加热，因而避免了高温杀菌对食品风味的破坏作用，尤其对热敏感的物质更具有重要意义。还可以添加到乳粉中，使牛乳人乳化，以抑制肠道中腐败微生物的生存，同时直接或间接促进肠道中双歧杆菌的增殖。此外，还能利用溶菌酶生产酵母浸膏和核酸类调味品。

2. 在生物工程研究中的应用

随着生物科学的发展，溶菌酶已成为基因工程及酶工程中必不可少的工具酶，用以制造和提取菌体内的活性物质如核酸、酶及活性多肽等，利用其专一性水解细胞壁的特点，有助于人们对细胞壁细微结构的认识，为我们深入研究细胞壁的构造打下了坚实的基础，同时作为是一种重要的破壁酶，在原生质体的制备方面提供了新的方法，因此溶菌酶被广泛应用于生物技术、生物工程中。

3.  溶菌酶在畜禽饲料中的应用

1）用作饲料防腐剂和杀菌剂：由于溶菌酶本身是一种天然蛋白质，无毒性，是一种安全性高的饲料酶，它能专一性的作用于目的微生物的细胞壁，而不能作用于其它物质。该酶对革兰氏阳性菌、枯草杆菌、耐辐射微球菌有很强分解作用；对大肠杆菌、普通变形菌和副溶血弧菌等革兰氏阴性菌等也有一定的杀灭作用；与聚合磷酸盐和甘氨酸等配合使用，具有良好的防腐作用。在饲料中添加溶菌酶可防止霉变，延长饲料的贮存期，减少不必要损耗。

2）具有防治仔猪腹泻的作用：溶菌酶对防治仔猪腹泻有显著作用，可达到抗生素的使用效果，治愈率达80%以上。溶菌酶与免疫球蛋白的功能紧密联系体内溶菌酶主要来自嗜中性白细胞、单核细胞及吞噬细胞溶酶体，可进入机体补体系统并增强抗体活性，从而杀灭有害微生物，因此溶菌酶对引起仔猪腹泻的埃希氏大肠杆菌和轮状病毒都具有较强的抑制作用。

【提取】

1. 直接结晶法

此法操作简单，成本低，但不能用以分离微量的溶菌酶。

2. 亲和色谱法

此法分离提纯的倍数较高，质量较好，且可广泛应用于各种来源的溶解酶，用于浓缩和精制微量的溶解酶。但由于亲和吸附剂的制作复杂，限制了它在工业上的大规模利用。

3. 离子交换法( Ion- exchange chromatography)

利用溶液中各种带电粒子与离子交换剂之间结合力的差异进行物质分离的操作技术，由于具有简便、高效、成本低，且可自动化连续操作的优点，因此一直以来都是溶菌酶生产所常用的方法。常用的离子交换剂有Duolite- 464、羧酸纤维素( PC) 、羧甲基纤维素( CMC) 和羧甲基琼脂糖等。此法具有简便、高效、成本低、且可自动化连续操作的优点。

4. 超滤与亲和色谱法结合

这是近年来开发的新方法。首先用超滤除去大部分杂蛋白，保留溶解酶，但此时它还是粗酶，再用亲和色谱法得到精制产品。

【制备】

1. 天然资源的溶菌酶的制备

1）鸡蛋清溶菌酶的制备

鸡蛋清中溶菌酶的含量约为3.5 %，是提取溶菌酶的方便来源。但不同产地的鸡蛋，其蛋清中溶菌酶的含量也有所不同。工业上多采用直接结晶法、亲和色谱法、离子交换法、超滤与亲和色谱联合使用等方法生产溶菌酶。采用控制温度、调酸和加盐的分离纯化工艺将溶菌酶分离，之后利用超滤和喷雾干燥方法制成产品，产品活力达11 000 U/mg。利用亲和沉淀从蛋清中分离溶菌酶也是溶菌酶制备研究的一个热点。

2）萝卜溶菌酶的制备

国内有人在对华南地区50 多科120 多种植物进行普查中，发现十字花科萝卜叶中溶菌酶含量最高，且发现萝卜溶菌酶的耐热性、耐酸性均优于鸡蛋清溶菌酶。进一步研究发现，该酶的抑菌效果与现在普遍生产和应用的鸡蛋清溶菌酶有所不同。该酶不但对白色葡萄球菌等3 种革兰氏阳性菌，而且对大肠杆菌等6种格兰氏阴性菌及酵母、毛霉等5 种真菌具有不同程度的抑制作用，对另外参试的白菜软腐病等7 种植物病原细菌、真菌及烟虫和小菜蛾两种昆虫都有抑杀作用。

萝卜溶菌酶抑菌的广谱性和较强的抑菌能力，以及原料成本低廉等特点，都为萝卜溶菌酶提供了良好的应用前景。

3）马奶溶菌酶的制备

将蒙古马奶经过硫酸铵沉淀，乳清蛋白脱盐，DEAE - Sephadex A- 25，Sephadex G- 100，CMSephadexC- 25 柱层析分离得到马奶溶菌酶，产率为38 mg/L马奶。

3. 利用基因工程技术制备溶菌酶

以噬菌体T7DNA 为模板，PCR 扩增T7 溶菌酶基因，插入pBluescript SK 载体。DNA 序列分析表明，克隆的T7 溶菌酶基因和已报道的序列无水平上的差异。将T7 溶菌酶基因分别拼接在烟草病原相关蛋白( PRlb) 信号肽码序列的3’末端和马铃薯卷叶病毒外壳蛋白( PLRV CP) 基因靠近3’末端处，构建成两个融合蛋白基因。将T7 溶菌酶及其融合蛋白基因插入大肠杆菌表达载体pBV221，实现T7 溶菌酶基因在大肠杆菌中的高效表达，其产物的表达量占菌体可溶性蛋白的20 % 以上。

【主要参考资料】

[1] 曹涛, 刘同军, 王艳君. 微生物溶菌酶的研究及应用[J]. 中国调味品, 2011, 36(3): 23-26.

[2] 陈艳, 江明锋, 叶煜辉, 等. 溶菌酶的研究进展[J]. 生物學雜誌, 2009, 26(2): 64-66.

[3] 李鹤, 马力, 王维香. 溶菌酶的研究现状[J]. 食品研究与开发, 2008 (1): 182-185.

[4] 临床常用药物