原蕨苷的制备

背景及概述^[1][2]

蕨菜，又叫拳头菜、猫爪、龙头菜、鹿蕨菜、蕨儿菜、猫爪子、拳头菜、蕨苔、锅莲，是蕨的嫩芽。英文名：Pteridiumaquilinum，属于凤尾蕨科。喜生于浅山区向阳地块，多分布于稀疏针阔混交林。在我国西北、华北、东北、西南及华中各省区都有广泛的分布。其食用记载最早始于《诗经》：“陟坡南山，言采其蕨”，据《本草纲目》记载：蕨味甘寒,具清热、滑肠、降气、驱风、化痰等功效，主治食膈、气膈、肠风热毒等病症。

然而，目前研究发现，蕨菜中存在一种被称为原蕨苷(原蕨苷quiloside，原蕨苷，CAS：87625-62-5)的化合物，它是蕨菜中的主要致癌物质，其结构如下所示：

原蕨苷

在体内和体外的研究都表明，原蕨苷具有细胞和基因毒性与尿道和胃肠道中的肿瘤发生直接相关。同时流行病学研究也证明人群在蕨类生长密集的地区居住时间与患胃癌死亡的风险正相关，而在童年时暴露于原蕨苷的人群在成年后发生恶性肿瘤的几率是未暴露人群的两倍以上(OR＝2.34)。此外研究还发现除了直接食用蕨菜外，通过被原蕨苷污染的牛奶、畜禽肉、甚至地下水均可受到原蕨苷影响。目前，原蕨苷被世界癌症组织评级为2B类致癌物，而原蕨苷在蕨类植物的嫩芽中含量最高。

目前，蕨菜产业已有一定的规模，为了食品的安全，有必要对蕨菜中的原蕨苷含量进行监控和控制。然而，目前国内尚没有高纯度原蕨苷标准品的销售，这对蕨菜产品的质量控制造成了困难。

制备及提纯[2]

1、原蕨苷的提取

原料采用新鲜的蕨菜。经40℃干燥72h，并粉碎成分经200目过筛后，按照料液比1:10(40g蕨菜，400mL蒸馏水)(1:10至1:100均可，本实施例具体为1:10)，4℃震荡提取60min。提取物于4℃，5000rpm离心10min，取上清液进一步纯化。

2、提取物中干扰物质的去除

水提取物中除含原蕨苷外，还存在大量的复合物(一些多糖、蛋白质、厥素B等水溶性物质)，会干扰后期原蕨苷的检测，故将这些干扰物质去除。特别是厥素B，在一定的条件下，原蕨苷会转化为厥素B。需要进一步净化除去干扰物质。具体为：

(1)取200mL粗提液以重力法过柱(1.0×20cm玻璃小柱，5.00g聚酰胺6树脂(购自sigma)，干法装柱)，前100mL洗脱液直接用于进一步净化，后100mL洗脱液需二次过柱。合并洗脱液(200mL)进一步纯化。

(2)洗脱液再以XAD2柱纯化，即以2滴/s的速度使样品过吸附柱(2.5×20cm玻璃小柱，20mLAmberliteXAD2resin(购自sigma)，湿法装柱)，弃去流出液。吸附柱再用蒸馏水洗脱三次，每次15mL，丢弃蒸馏水洗脱液。最后以甲醇洗脱吸附柱三次，每次15mL，合并甲醇洗脱液。置于旋转蒸发仪，低压，45℃，浓缩至近干。残留物溶于10mL蒸馏水中移出，再以5mL蒸馏水洗涤两次，合并溶解液。

(3)合并的溶解液再过柱净化(1.0×10cm玻璃小柱，1.00g聚酰胺6树脂，干法装柱)。最初的2mL洗脱液弃去，其余的洗脱液再经ChemElut1020硅藻土固相萃取柱(购自瓦里安)进一步进化。用色谱纯乙酸乙酯洗脱固相萃取柱，洗脱液收集在圆底烧瓶中，低压，45℃，浓缩近干。得到0.20g微黄色胶状物即为原蕨苷粗品。可充氮-20℃保存待用。

3、原蕨苷的制备HPLC纯化

由于原蕨苷粗品纯度在20％，可用50％甲醇溶液溶解后以制备型HPLC进行分离纯化。分离条件：流动相为50％甲醇：水，制备型色谱柱(C-18，10uM，25×250mm,购自安捷伦)，流速：3mL/min,柱温25℃，检测波长254nm。结果如图2所示收集主峰的流出组分。流出组分经减压浓缩后冻干后得到0.04g原蕨苷纯品于-20℃保存待用。按原料中原蕨苷含量为4000ug/g(干重)计算，因此收率为25％。

主要参考资料

[1] 欧玉静, 王晓梅, 李春雷, & 朱亚龙. (2017). N-甲基吡咯烷酮的应用进展. 化工新型材料, 45(8), 241-243.

[2] 张军, & 唐建兴. (2011). N-甲基吡咯烷酮合成技术分析. 合成技术及应用, 26(4), 19-23.

[3] 贾太轩, 姜雄华, & 冯世宏. (2004). N-甲基吡咯烷酮的最新研究进展. 辽宁化工, 33(11), 642-644.