比伐卢定的制备方法

概述^[1]

比伐卢定(Bivalirudin)属于直接凝血酶抑制剂(direct thrombin inhibitor，DTI)，由20个氨基酸残基组成。比伐卢定为水蛭素衍生物(片段)，人工合成的包含20个氨基酸残基的多肽。它主要由两部分构成，一部分是氨基末端(N端)的短肽链，含有苯丙氨酸‑脯氨酸‑精氨酸‑脯氨酸序列，能与凝血酶的活性部位发生特异性结合，另一部分是含羧基末端(C端)的12肽链，两部分靠四甘氨酸连接，它们与凝血酶的两个结合部位都有很高的亲和力。比伐卢定与凝血酶的结合是可逆的，结合后很容易在凝血酶的活性部位断开成两部分并分解出多肽链中的脯氨酸‑精氨酸序列，使凝血酶的催化活性很快恢复，所以它的半衰期只有20～25min。

制备方法^[2]

1：Fmoc-Pro-Gly-OH的合成

2：Fmoc-Gly-Gly-Gly-OH的合成

3：Fmoc-Pro-Gly-Gly-OH的合成

4：Fmoc-Gly-Gly-Asn(Trt)-OH的合成

5：肽树脂1:Leu-WangResin的合成

6：肽树脂2:Tyr(tBu)-Leu-WangResin的合成

7-19：肽树脂3-肽树脂15的合成

21：比伐卢定肽树脂的酸解得比伐卢定粗品

20制得的比伐卢定肽树脂673.5g，加入酸解试剂（TFA：TIS：EDT：H2O=95：1：2：2）6735ml，搅拌室温反应2小时，反应物用砂芯漏斗过滤，并用TFA洗涤树脂3次（每次600ml），过滤，合并滤液，滤液减压浓缩至600-800g，加3L无水乙醚研磨，析出固体，固体用砂芯漏斗过滤，并用乙醚洗涤固体3次（每次400ml），过滤，得白色粉末状比伐卢定粗品330g。

22：比伐卢定粗品溶液的制备

21制得的还原型比伐卢定粗品330g，加4L水溶解，搅拌下滴加10%碳酸钠溶液调PH值4-5，用0.45μm混合滤膜过滤，得比伐卢定粗品溶液。

23：比伐卢定的制备

高效液相色谱法纯化：22制得的比伐卢定粗品溶液，加纯水溶液至6400ml得比伐卢定粗品溶液，备用。色谱柱填料为9μm的反相C18，流动相A：0.1%TFA-H2O，流动相B：0.1%TFA-CH3CN，色谱柱为100mm×270mm，流速为120ml/min，采用梯度洗脱。取比伐卢定粗品溶液，分16次上样于色谱柱中，每次400ml，启动制备程序进行洗脱，收集、合并合格产品溶液，用旋转蒸发仪、38～40水浴条件下减压浓缩，蒸去大部分乙腈，用0.45μm滤膜过滤，得比伐卢定纯化浓缩液3500ml，用于制备高效液相色谱进行换盐。

高效液相色谱法换盐：比伐卢定纯化浓缩液3500ml，加纯水至4500ml得比伐卢定纯化溶液，备用。色谱柱填料为9μm的反相C18，流动相A：1%HOAc-H2O，流动相B：CH3CN，色谱柱为100mm×270mm，流速为125ml/min，采用梯度洗脱。取比伐卢定纯化溶液，分15次上样于色谱柱中，每次300ml，启动制备程序进行洗脱，收集、合并合格产品溶液，用旋转蒸发仪、38～40水浴条件下减压浓缩，蒸去大部分乙腈，用0.45μm滤膜过滤，得比伐卢定三氟醋酸盐浓缩液2000ml，用于冻干。

取得比伐卢定醋酸盐浓缩液2000ml，冷冻干燥，得产品192.0g，总收率为55.0%，纯度99.85%。

主要参考资料

[1] 孙婧, 田军, 刘军翔, 杨国红, 李东霞, & 赵季红, et al. (2014). 国产比伐卢定用于急性st段抬高型心肌梗死患者急诊介入治疗术中的临床研究. 中国循环杂志(7), 497-500.

[2] 比伐卢定多中心临床研究协作组, & CooperativeGroupofDomesticBivalirudinMultiCenterClinicalTrial. (2011). 国产比伐卢定用于冠状动脉介入治疗术中抗凝的疗效和安全性评价. 中国循环杂志(5).

[3] 边素艳, & 盖鲁粤. (2007). 直接凝血酶抑制剂比伐卢定临床研究进展. 中国介入心脏病学杂志, 15(3), 178-180.