芥子碱的制备方法

背景及概述^[1-2]

芥子碱(sinapine)广泛存在于十字花科植物中，在十字花科植物的生理代谢调控、提高植物抗病性和改善营养品质等方面起着非常重要的作用。近年来的研究揭示了芥子碱不仅是一种非常有价值的天然抗氧化剂，在抗衰老药物的研究中具有重要意义，还具有显著的降血压、抗炎、抗腹泻和抗雄激素活性等功效。芥子碱具有显著的抗氧化、抗辐射、抗衰老、降血压、抗炎、抗腹泻和抗雄激素等多种生物活性，且芥子碱主要存在于十字花科植物中，价格低廉，来源相当广泛，提取制备方法简便，对其开发成新型药物有着广阔的应用前景。但从安全性和有效性的角度考虑，应从临床应用较多的《中国药典》收载的品种中提取分离该物质更为合理。

理化性质^[1]

芥子碱为季铵盐生物碱，其结晶体为棕色针状，易溶于水、甲醇和乙醇，热稳定(100℃)，熔点为179℃，在326nm处有一紫外吸收峰，在弱酸性溶液中稳定，但在碱性溶液中不稳定，易分解为芥子酸和胆碱。芥子碱在自然界中只有极少一部分是以单体的形式存在，常与有机酸结合成盐而存在，或以糖苷、有机酸酯和酰胺的形式存在，而在常用十字花科药用植物中以芥子碱硫氰酸盐(图1)的形式存在最为广泛。芥子碱水溶液加数滴1mol/LNaOH后，溶液呈黄色，紫外灯下有绿色荧光；加数滴1mol/HC1，溶液呈淡红色，紫外灯下有蓝色荧光；加数滴浓HNO3，溶液呈深红棕色。

生物活性^[1]

1. 抗辐射和抗氧化作用：顾瑞琦通过几种十字花科植物幼芽提取液对元麦和小麦萌发种子和辐射保护作用实验已经证明芥子碱或其衍生物是十字花科植物具有较强的抗辐射性能的物质基础，在体外芥子碱能有效清除活性氧自由基，对动植物有较强的辐射保护作用。在芥子碱的辐射保护作用中，芥子碱的酚基起主要作用，而不是它的芳香基团。与DMSO(强有力的·OH清除剂)不同的是，芥子碱不仅能显著减少DNA链的断裂，而且有较大的抗碱基损伤作用，其机制大概有两种：①对于DNA链的断裂，是通过清除·OH，从而减少了攻击脱氧核糖的可能性；②对于碱基损伤，是通过转移碱基上的电子而起作用。从生物学效果来看，DNA链断裂的后果比碱基损伤更严重，芥子碱在辐射和活性氧攻击中不仅可以防止碱基损伤，而且能更有效地减少DNA链的断裂，因此它是一种非常有价值的辐射保护物质。

2.抗衰老作用：衰老是一个极为复杂的过程，自由基学说只能解释其部分现象，不能解释衰老过程的全部表现，但自由基促使衰老过程加快的作用是确切的。外界不良环境刺激可使衰老过程加速，而在生物体自身的衰老过程中活性氧自由基也是一个不可忽视的因素。通过十字花科植物中的芥子碱对果蝇的抗衰老作用实验发现，其作为超氧阴离子自由基和羟自由基的清除剂，在适当浓度下，不仅能延长果蝇的平均寿命和半数寿命，而且也能延长果蝇的最高寿命，显示出具有一定的抗衰老作用。但由于抗衰老药物具有不同于一般药物的特殊性，其服用时间较长，总的吸收剂量较大，而且作用过程比较缓和，芥子碱对果蝇的延寿作用并不随服用剂量的增加而提高，其抗衰老作用只有在适当剂量下，才能表现出一定的效果。

3. 抗放射作用：通过芥子碱对辐照后小鼠外周血象变化的影响实验发现芥子碱能够显著缓解辐照后小鼠外周血中血小板和白细胞的减少，而对血红蛋白的变化无显著影响；并且能够显著促进外周血中血小板水平的恢复。在已有的抗放药物中，动物口服效价低，且毒性反应明显。小鼠毒性实验表明，芥子碱实际为无毒物质，这成为芥子碱有别于人工合成抗放药物的一个最显著的特点。

4.抗炎和抗腹泻作用：芥子碱可抑制二甲苯引起的小鼠耳壳肿胀和组织胺引起大鼠皮肤毛细血管通透性增高，可减少蓖麻油和番泻叶引起小鼠腹泻次数和发生频率，具有抗炎和抑制胃肠推进运动的作用，两者都是其抗腹泻机制。但芥子碱抑制胃肠推进运动的作用弱且无量效关系，所以推测抗炎是其抗腹泻的主要机制。咖啡酸(3，4-二羟基苯丙烯酸)和阿魏酸(3-甲氧基-4-羟基苯丙烯酸)具有抗腹泻作用，抗炎是它们抗腹泻的主要机制。芥子碱灌胃后在肠道被分解或经肝脏被迅速水解成无毒的胆碱和芥子酸，而芥子酸的化学结构与咖啡酸、阿魏酸类似，都为4-羟基苯丙烯酸类化合物，推测芥子酸可能是芥子碱的抗炎抗腹泻的活性代谢物。

5. 降压作用：李晶[8]等采用自发性高血压大鼠动物模型，探讨芥子碱的降压作用。结果表明，芥子碱具有确切的慢性降压作用，且对心率无影响，起效时间短。同时芥子碱对麻醉闭胸犬平均动脉压、收缩压及舒张压均有明显的降低作用，对心率同样无影响，提示芥子碱降压作用可能是通过松驰血管平滑肌实现的。

6. 抗雄激素活性：]通过丙酸睾酮诱导的去势小鼠前列腺增生动物模型进行芥子碱的药效实验，结果表明：芥子碱能显著抑制丙酸睾酮诱发的去势小鼠前列腺增生，降低小鼠包皮腺、精囊腺湿重，降低血清酸性磷酸酶活力，具有显著的抗雄激素活性作用。理论上，抑制雄激素与受体结合和5α-还原酶活性，或直接的细胞毒作用等都可能使丙酸睾酮诱发的去势小鼠前列腺增生受到抑制。而芥子碱是一种季胺盐物质，其抗雄激素的分了机制有待进一步研究。

毒性研究^[1]

1. 抗营养效应：芥子碱在自然界中不稳定，易被酯酶、β-葡(萄)糖苷酶、阿魏酸酶(FAE)等酶解成芥子酸和胆碱，而芥子酸能导致精子不成熟，引起生殖功能障碍。在用油菜、芥菜等其他十字花科植物饲喂家畜时应做处理或限制用量在5%以内。芥子碱具有苦辛味，影响饲料的适口性和动物的采食量，但对蛋白的吸收和利用没有影响。但重要的是，一些体内缺乏三甲胺(trimethylamine)氧化酶的褐壳系蛋鸡，采食芥子碱后产腥味蛋，这是因为芥子碱在鸡胃肠道内转变为三甲胺后，不能被氧化而导致的三甲胺累积直接进入蛋中而产生腥味。而蛋鸡日粮中芥子碱的量低于0.1%时，则不会产腥味。通过育种降低双低油菜中介子碱的量，可进一步提高鸡蛋的营养价值。因此，逐步降低芥子碱在油菜籽中的量成为一个必须攻克的课题。以前工作主要集中在抑制芥子碱在成熟种子的合成，采用基因克隆的新技术，通过dsRNAi构建设计编码芥子碱葡萄糖转移酶的基因片断BnSGT1，特异性地沉默芥子碱在十字花科植物中的生物合成代谢，结果发现芥子碱在T2和T3种子中的量分别降低了61%和76%，而它们的含油量、蛋白质、脂肪、多糖等物质没有变化。可见，通过转基因技术降低芥子碱葡萄糖转移酶的生物合成从而大幅度地降低芥子碱在油菜籽等十字花科植物中的量，可能是当前解决芥子碱抗营养效应的一个新思路。

2. 急性毒性：通过毒性实验发现，当芥子碱累积饲喂量达到每只小鼠每千克体重9.6g的水平时，芥子碱组和对照组小鼠的活动能力和纳食能力没有明显关别，两组小鼠存活率都为100%，表明芥子碱对小鼠为实际天然无毒物质。上海市化学品毒性检写所的测试报告表明，发现在饲喂芥子碱后连续7d的观察时间里，受试小鼠无不良症状出现，无死亡发生，小鼠经口急性服药的毒性MLD>10g/kg。

制备^[3]

1. 热醇提取法

热醇提取法是一种传统的提取有效成分的方法。菜籽粕经石油醚脱脂处理后，采用优选的热醇提取工艺，即提取温度85．5℃、甲醇－乙醇(3∶5)、料液比1∶26进行粗提。结果显示：菜籽饼浸膏和结晶物的提取率达到了10．01%和2．54%。采用正交设计和响应曲面2种方法优化白芥子药材中芥子碱的热醇提取工艺，当用40倍量65%乙醇在60℃下加热回流提取5h时，芥子碱的得率最高。

2. 微波和超声辅助提取法

采用热醇提取法、超声波辅助提取法和微波辅助提取法对白芥子药材中芥子碱的提取工艺进行优化。结果表明：微波辅助提取比热醇提取法的提取效率提高了89%，而超声波辅助提取比热醇提取的提取效率提高了85%。

3. 萃取法

利用索氏提取法和加速溶剂萃取法，优化了菜籽饼中芥子碱的提取工艺参数，有效提高了芥子碱的提取效率。菜子饼中芥子碱的索氏提取工艺为：提取时间3．93h、提取温度85．5℃、溶剂比3∶5，料液比1∶26，此条件下芥子碱的得率达1．57%。加速溶剂萃取法的工艺为：萃取温度140℃、静态萃取时间15min、萃取3次，在此条件下芥子碱的得率为1．88%。

4. 芥子碱的纯化工艺

芥子碱的纯化方法有薄板层析法、柱层析法、大孔树脂吸附法和结晶法等，目前最常用的就是重结晶法和大孔树脂法纯化法。由于芥子碱难单独存在，因此，经过纯化得到的大多是芥子碱的硫氰酸盐。芥子碱等有效成分可以用薄层色谱法分离，所用的展开剂为正丁醇－乙酸－水(12∶3∶5)。文献分别采用不同的树脂对菜籽饼中的芥子碱进行了纯化。结果发现：DK－6是适合纯化芥子碱的树脂，其纯化工艺为：pH7.0、上样流速2BV·h－1、吸附时间120min、洗脱剂为90%乙醇、洗脱剂流速2BV·h－1、洗脱时间90min。产品经真空干燥后纯度可达49．89%。用硫氰酸盐沉淀法纯化芥子碱，可得到纯度较高的芥碱硫氰酸盐，结晶次数为3次，其纯度可达93．54%。重结晶法可得到纯度较高的芥子碱，80%乙醇提取所得结晶的得率和纯度均最高，分别为0．51%、95．70%，重结晶过程中加入的蒸馏水和20%KSCN对芥子碱结晶的得率和纯度都有影响。

主要参考资料

[1] 芥子碱的研究概况

[2] 芥子碱提取工艺的研究

[3] 芥子碱的研究进展