大鼠蛋白Z(PZ)ELISA试剂盒

背景^[1-7]

大鼠蛋白Z(PZ)ELISA试剂盒用于测定大鼠血清，血浆及相关液体样本中蛋白Z（PZ）的含量。

实验原理：本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中大鼠蛋白Z（PZ）水平。用纯化的大鼠蛋白Z（PZ）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入蛋白Z（PZ），再与HRP标记的蛋白Z（PZ）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的大鼠蛋白Z（PZ）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中大鼠蛋白Z（PZ）浓度。

结果计算：以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

样本处理及要求：

1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。

2.血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。

3.尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。

4.细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

5.组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。

6.标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融.

7.不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。

应用^[8][9]

大鼠蛋白Z(PZ)ELISA试剂盒可用于大肠杆菌丝状热敏蛋白Z相互作用蛋白A(Ec-ZipA)原核表达、纯化与大鼠多克隆抗体的制备

大肠杆菌丝状热敏蛋白Z相互作用蛋白A(Ec-ZipA)第185至328位氨基酸功能蛋白及其特异性大鼠多克隆抗体。方法以基因合成法合成Ec-ZipA第185至328位氨基酸功能蛋白的基因序列,利用DNA重组技术与p ET-30a(+)载体连接构建重组质粒。将重组质粒转化到E.coli BL21(DE3)中进行Ec-Zip A原核表达与表达优化。采用亲和层析方法分离纯化Ec-Zip A后,以荧光偏振(FP)实验进行生物学活性鉴定。以重组Ec-Zip A为抗原免疫大鼠制备多克隆抗体,采用ELISA和Western blot法检测抗体滴度和抗原特异性。

结果SDS-PAGE分析和Western blot实验证实大肠杆菌成功表达Ec-Zip A蛋白。FP实验表明纯化的Ec-Zip A具有良好的生物学活性。ELISA结果表明多克隆抗体具有较高的抗体滴度,效价可达1∶512 000。Western blot实验证实多克隆抗体具有良好的抗原特异性。结论成功进行了Ec-Zip A原核表达、分离纯化并制备了大鼠抗Ec-Zip A多克隆抗体。

参考文献

[1]FtsZ Polymers Tethered to the Membrane by ZipA Are Susceptible to Spatial Regulation by Min Waves[J].Ariadna Martos,Ana Raso,Mercedes Jiménez,Zdeněk Petrá?ek,Germán Rivas,Petra Schwille.Biophysical Journal.2015(9)

[2]Reconstitution of the Escherichia coli cell division ZipA–FtsZ complexes in nanodiscs as revealed by electron microscopy[J].Journal of Structural Biology.2012(3)

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[4]FtsZ polymers bound to lipid bilayers through ZipA form dynamic two dimensional networks[J].Pablo Mateos-Gil,Ileana Márquez,Pilar López-Navajas,Mercedes Jiménez,Miguel Vicente,Jesús Mingorance,Germán Rivas,Marisela Vélez.BBA-Biomembranes.2011(3)

[5]Development of a fluorescence polarization assay to screen for inhibitors of the FtsZ/ZipA interaction[J].Cynthia Hess Kenny,Weidong Ding,Kerry Kelleher,Susan Benard,Elizabeth Glasfeld Dushin,Alan G.Sutherland,Lidia Mosyak,Ronald Kriz,George Ellestad.Analytical Biochemistry.2003(2)

[6]The keepers of the ring:regulators ofFts Z assembly.Ortiz C,Natale P,Cueto L,et al.FEMS Microbiology Reviews.2016

[7]coli cell cycle machinery.Lutkenhaus J,Du S.E.SubcellBiochem.2017

[8]Escherichia coliZip A organizes Fts Z polymers into dynamic ring-like protofilamentstructures.Krupka M,Sobrinos-Sanguino M,Jiménez M,et al.MBio.2018

[9]陈云雨,牛夏忆,林媛,刘晓平.大肠杆菌丝状热敏蛋白Z相互作用蛋白A(Ec-ZipA)原核表达、纯化与大鼠多克隆抗体的制备[J].细胞与分子免疫学杂志,2018,34(10):942-948.