荧光定量PCR引物

背景^[1-6]

荧光定量PCR引物是指在核苷酸聚合作用起始时，刺激合成的一种具有特定核苷酸序列的大分子，与反应物以共价键形式连接，这样的分子称为引物。引物通常是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与靶区域一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与靶区域另一端的另一条DNA模板链互补，其功能是作为核苷酸聚合作用的起始点，核酸聚合酶可由其3端开始合成新的核酸链。

体外人工设计的引物被广泛用于聚合酶链反应、测序和探针合成等。实时荧光定量PCR是利用荧光染料（具有双链DNA亲和性）或荧光标记短核苷酸探针（利用Taq酶的5’→3’外切酶活性）的荧光活性，在PCR反应的的过程中，每个循环收集一个荧光强度信号。随着PCR反应产物量的增加，荧光信号强度也等比例增强。RT-qPCR反应完成后通过对PCR扩增反应中每一个循环后荧光信号强度变化的监测可得到一条荧光扩增曲线图，进一步可计算出相对应的产物量的变化，从而实现对起始模板定量及定性的分析。

引物是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与目的基因一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与目的基因另一端的另一条DNA模板链互补。在PCR（聚合酶链式反应）技术中，已知一段目的基因的核苷酸序列，根据这一序列合成引物，利用PCR扩增技术，目的基因DNA受热变性后解链为单链，引物与单链相应互补序列结合，然后在DNA聚合酶作用下进行延伸，如此重复循环，延伸后得到的产物同样可以和引物结合。

PCR引物设计的目的是找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。如前述，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。对引物的设计不可能有一种包罗万象的规则确保PCR的成功，但遵循某些原则，则有助于引物的设计。

引物设计有3条基本原则：首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配)。

具体实现这3条基本原则需要考虑到诸多因素，如引物长度（primer length），产物长度（product length），序列Tm值(melting temperature)，引物与模板形成双链的内部稳定性(internal stability,用∆G值反映)。

形成引物二聚体(primer dimer)及发夹结构（duplexformation and hairpin）的能值，在错配位点（false priming site）的引发效率，引物及产物的GC含量（composition），等等。必要时还需对引物进行修饰，如增加限制性内切酶位点，引进突变等。

应用^[7][8]

荧光定量PCR引物可用于荧光定量PCR检测实验：

荧光定量PCR方法为技术基础,建立了一种能单管同时鉴别三种动物衣原体的TaqMan-MGB探针多重荧光定量PCR方法,该方法特异、灵敏且稳定性良好。主要研究内容包括以下几方面：

1、通过对GenBank中衣原体科的9种衣原体主要外膜蛋白序列进行比对分析,应用Primer Express3.0生物学软件设计了3对特异的引物,3条探针和1对通用引物。采用通用引物进行PCR扩增,构建阳性质粒,将其阳性质粒测序结果与GenBank中已发表的主要外膜蛋白序列进行比对。结果表明：构建的阳性质粒与GenBank中发表的主要外膜蛋白序列相似性分别达达99%、97%、96%。

2、通过对三种衣原体(家畜嗜衣原体、流产嗜衣原体、鹦鹉热衣原体)的单重荧光定量PCR引物浓度、探针浓度和Tm值的优化,分别建立了家畜嗜衣原体、流产嗜衣原体、鹦鹉热衣原体的单重荧光定量PCR检测方法。并进行了相应的特异性试验、灵敏度试验,建立了相应的标准曲线。动物衣原体病((Chlamydiosis)是由各类衣原体(Chlamydia)感染哺乳动物、禽类等动物所发生的一类十分重要的自然疫源性传染病。该病呈地方流行,常造成较大的危害及经济损失。

目前针对的衣原体的检测方法有细胞培养法、间接血凝试验(1HA)、直接染色观察等方法,但以上检测方法对于快速准确的检测衣原体尚存在较大的局限,如细胞培养法容易受到支原体的污染、灵敏度较低；间接血.凝试验虽然操作比较简单,但批次间差异较大、阳性检出率较低；直接染色观察灵敏度较低。因此,急需建立一种快速、简捷、特异、灵敏、稳定性好的检测方法,用于衣原体的早期诊断、疫情监控、流行病学调查等。

参考文献

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[4]Detection of Chlamydia suis from clinical specimens:comparison of PCR,antigen ELISA,and culture[J].Journal of Microbiological Methods.2003(2)

[5]Detection of Chlamydophila(Chlamydia)abortus and Toxoplasma gondii in Smears from Cases of Ovine and Caprine Abortion by the Streptavidin–Biotin Method[J].L.Szeredi,á.Bacsadi.Journal of Comparative Pathology.2002(4)

[6]Genetic Characterization of a Chlamydophila pneumoniae isolate from an African Frog and Comparison to Currently Accepted Biovars[J].Helmut Hotzel,Ernst Grossmann,Frank Mutschmann,Konrad Sachse.Systematic and Applied Microbiology.2001(1)

[7]Multiplex PCR for rapid and differential diagnosis of Mycoplasma pneumoniae and Chlamydia pneumoniae in respiratory infections[J].Daniele Corsaro,Marcello Valassina,Danielle Venditti,Veronique Venard,Alain Le Faou,Pier Egisto Valensin.Diagnostic Microbiology&Infectious Disease.1999(2)

[8]袁曾壮.动物衣原体TaqMan-MGB探针多重荧光定量PCR方法的建立及应用[D].西南大学,2014.