人醛缩酶(ALD)Elisa试剂盒的应用

背景^[1-3]

人醛缩酶(ALD)Elisa试剂盒采用双抗体夹心ABC-ELISA法。用抗人醛缩酶(ALD)单抗包被于酶标板上，标准品与样品中的人醛缩酶(ALD)与单抗结合，加入生物素化的抗人醛缩酶(ALD)抗体，形成免疫复合物连接在板上，辣根过氧化物酶标记的Streptavidin与生物素结合，加入酶底物TMB,出现蓝色，加终止液硫酸，颜色变黄，在450nm处测OD值，人醛缩酶(ALD)浓度与OD值成正比，可通过绘制标准曲线求出标本中人醛缩酶(ALD)浓度。

人醛缩酶(ALD)Elisa试剂盒

人醛缩酶(ALD)Elisa试剂盒标本收集与试剂准备:

1.血清、血浆样本收集应使用一次性的无热原，无内毒素试管（EDTA、柠檬酸盐、肝素抗凝均可），血清、血浆避免使用溶血，高血脂标本，标本悬浮物应离心去除，使标本清澈透明。待测样本应尽早检测，2-8℃保存48小时；更长时间须冷冻（-20℃或-80℃）保存，避免反复冻融。

2.洗涤液配置：用蒸馏水1:20稀释（示例：1ml浓缩洗涤液加入19ml的蒸馏水）

3.标准品配制：取7个1.5ml离心管，分别标注1/2,1/4,1/8,1/16,1/32,1/64，blank。从第壹至七管中分别加入标准品/样品稀释液200ul。在第壹管中加入标准品溶液200ul，置于漩涡混合器上混匀后用加样器吸出200ul，移至第二管。如此反复作对倍稀释，从第六管中吸出200ul弃去，第七管为空白对照。

4.生物素化抗体工作液配置:使用前20分钟，用生物素化抗体稀释液将100×生物素化抗体稀释成1×工作液，根据所需用量配置，当日使用，剩余弃之。

5.TMB显色液的配置：使用前10分钟，将TMB显色液A液和B液1：1混合，避光放置备用。

6. 如果检测的样本中靶蛋白浓度高于标准品最糕值，建议重新检测，请根据实际情况，适当倍数稀释(建议做预实验，以确定稀释倍数)。

人醛缩酶(ALD)Elisa试剂盒操作步骤：

1.标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10孔，在第一、第二孔中分别加标准品100μl，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50μl，混匀；然后从第一孔、第二孔中各取100μl分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl，混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉，再各取50μl分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取50μl分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第七、第八孔中分别取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第九第十孔中各取50μl弃掉。（稀释后各孔加样量都为50μl，浓度分别为72 pg/mL，48 pg/mL，24pg/mL，12 pg/mL，6 pg/mL）。

2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。

4.配液：将30（48T的20倍）倍浓缩洗涤液用蒸馏水30（48T的20倍）倍稀释后备用。

5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

6.加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。

7.温育：操作同3。

8.洗涤：操作同5。

9.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟.

10.终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。

测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。测定应在加终止液后15分钟以内进行。

应用^[4][5]

人醛缩酶(ALD)Elisa试剂盒可以用于乙型肝炎病毒主S蛋白相互作用蛋白—醛缩酶B验证及功能研究

证实醛缩酶B作为乙型肝炎病毒主S蛋白结合蛋白一种候选蛋白,探讨醛缩酶B生物学功能。

方法:(1)以人HEPG2细胞RNA为模板,用RT-PCR方法扩增出ALDOB基因。将PCR产物克隆进真核载体PCMV5内,构建含ALDOB基因的重组真核表达质粒。以实验室重组全S质粒为模板,利用PCR扩增主S蛋白基因,构建PCMV4-Flag-主S基因表达质粒,分别将重组质粒转染293FT细胞,用人醛缩酶(ALD)Elisa试剂盒免疫荧光和Western blot等方法检测ALDOB及主S在293FT细胞中的表达。(2)将两种质粒共转293T细胞,激光共聚焦试验明确主S蛋白和醛缩酶B空间定位。将主S基因表达质粒稳转HepG2细胞,构建主S稳转株,通过免疫共沉淀方法,验证主S蛋白与醛缩酶B相互结合。(3)构建靶向醛缩酶B重组干扰质粒siALDOB-Pu6,导入HEPG2细胞中,筛选出干扰质粒的稳转株。通过细胞增殖实验、Transwell实验、细胞凋亡实验,探讨ALDOB在肝癌细胞HepG2生长、侵袭、凋亡等方面的作用。

人醛缩酶(ALD)Elisa试剂盒结果:(1)核酸序列分析的结果表明,克隆的ALDOB基因与主S基因在GenBank中分别与已登记基因序列100%同源。人醛缩酶(ALD)Elisa试剂盒免疫荧光结果显示:ALDOB蛋白在细胞质表达;主S蛋白主要存在于细胞质中。Western blot结果显示:在约40KD位置有目的条带,与预期的重组ALDOB蛋白大小一致;在约26KD位置有预期的主S蛋白表达。(2)通过免疫共沉淀方法,成功确认醛缩酶B是乙型肝炎病毒主S蛋白结合蛋白一种候选蛋白。(3)特异性抑制ALDOB表达的HepG2细胞株较没有抑制ALDOB的HepG2细胞株,细胞增殖加快、侵袭能力增强、凋亡率增加。稳定干扰ALDOB的HepG2细胞稳转株较稳转空载Pu6的HepG2细胞株生长结论:(1)成功构建了含ALDOB基因以及主S基因的真核表达质粒。(2)醛缩酶B是乙型肝炎病毒主S蛋白的结合蛋白。(3)ALDOB能够抑制HepG2细胞增殖,使HepG2细胞侵袭能力下降,抑制HepG2细胞凋亡。

参考文献

[1]Hepatitis B in China[J].Jie Liu;;Daiming Fan.The Lancet,2007(9573)

[2]The hepatitis B virus X protein promotes hepatocellular carcinoma metastasis by upregulation of matrix metalloproteinases[J].Di‐PengOu;Yi‐MingTao;Fa‐QingTang;Lian‐YueYang.Int.J.Cancer,2007(6)

[3]Increasing specificity in high-throughput yeast two-hybrid experiments[J].Pierre-Olivier Vidalain;;Mike Boxem;;Hui Ge;;Siming Li;;Marc Vidal.Methods,2003(4)

[4]Hexokinase II and VEGF expression in liver tumors:correlation with hypoxia-inducible factor-1αand its significance[J].Seiichi Yasuda;;Shigeki Arii;;Akira Mori;;Naoki Isobe;;Weige Yang;;Hideaki Oe;;Akihisa Fujimoto;;Yoshikuni Yonenaga;;Hiromi Sakashita;;Masayuki Imamura.Journal of Hepatology,2003(1)

[5]赵洪波.乙型肝炎病毒主S蛋白相互作用蛋白—醛缩酶B验证及功能研究[D].福建医科大学,2011.