人组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)Elisa试剂盒的应用

背景^[1-3]

人组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)Elisa试剂盒采用双抗体夹心ELISA法。用抗人tPA抗体包被于酶标板上，实验时样品（或标准品）中的人tPA会与包被抗体结合。后依次加入生物素化的抗人tPA抗体和辣根过氧化物酶标记的亲和素，抗人tPA抗体与结合在包被抗体上的人tPA结合，生物素与亲和素特异性结合而形成免疫复合物，游离的成分被洗去。加入显色底物(TMB)，TMB在辣根过氧化物酶的催化下呈现蓝色，加终止液后变成黄色。用酶标仪在450 nm波长处测OD值，tPA浓度与OD450值之间呈正比，通过绘制标准曲线计算出样品中tPA的浓度。

PLAT(tissue-type plasminogen activator)组织型纤溶酶原激活剂（tissue-type plasminogen activator，t-PA）是一种在纤维蛋白溶解过程中发挥重要作用的蛋白酶。在血液中，t-PA通过将纤溶酶原（plasminogen）转化为纤溶酶（plasmin），促进血栓的溶解。t-PA主要由内皮细胞合成，与其功能相对的是纤溶酶抑制剂（plasminogen activator inhibitor，PAI），它可以抑制t-PA的活性。

人组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)Elisa试剂盒

人组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)Elisa试剂盒样品收集、处理及保存方法

1）血清-----操作过程中避免任何细胞刺激。使用不含热原和内毒素的试管。收集血液后，1000×g离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。

2）血浆-----EDTA、柠檬酸盐、肝素血浆可用于检测。1000×g离心30分钟去除颗粒。

3）细胞上清液---1000×g离心10分钟去除颗粒和聚合物。

4）组织匀浆-----将组织加入适量生理盐水捣碎。1000×g离心10分钟，取上清液

5）保存------如果样品不立即使用，应将其分成小部分-70℃保存，避免反复冷冻。尽可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量颗粒，检测前先离心或过滤。不要在37℃或更高的温度加热解冻。应在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。

人组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)Elisa试剂盒试剂的准备

1）标准品：标准品的系列稀释应在实验时准备，不能储存。稀释前将标准品振荡混匀。

2）洗涤缓冲液（50×）的稀释：蒸馏水50倍稀释。

人组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)Elisa试剂盒操作步骤

1）使用前，将所有试剂充分混匀。不要使液体产生大量的泡沫，以免加样时加入大量的气泡，产生加样上的误差。

2）根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。每个标准品和空白孔建议做复孔。每个样品根据自己的数量来定，能使用复孔的尽量做复孔。标本用标本稀释液1：1稀释后加入50ul于反应孔内。

3）加入稀释好后的标准品50ul于反应孔、加入待测样品50ul于反应孔内。立即加入50ul的生物素标记的抗体。盖上膜板，轻轻振荡混匀，37℃温育1小时。

4）甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。

5）每孔加入80ul的亲和链酶素-HRP，轻轻振荡混匀，37℃温育30分钟。

6）甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。

7）每孔加入底物A、B各50ul，轻轻振荡混匀，37℃温育10分钟。避免光照。

8）取出酶标板，迅速加入50ul终止液，加入终止液后应立即测定结果。

9）在450nm波长处测定各孔的OD值。

应用^[4][5]

人组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)Elisa试剂盒可以用于组织型纤溶酶原激活剂（t-PA）突变体乳腺特异性表达载体的构建及其细胞表达研究

研究以山羊β-乳球蛋白基因调控区为指导元件,以人组织型纤溶酶原激活剂F、E、K1区及Asp 117糖基化位点缺失体为表达序列,构建了乳腺特异性表达载体pBCrt-PA,转染山羊乳腺上皮细胞,筛选获得稳定表达细胞株。

应用PCR法以实验室保存的野生型t-PA cDNA为模板扩增出长度约1.1kb含K2和P区的t-PA部分序列。同时,合成一段长度为60bp的山羊β-乳球蛋白信号肽编码序列。利用定向克隆法,将山羊β-乳球蛋白信号肽编码序列插入到克隆载体pCEP4中。然后,将已扩增的t-PA cDNA序列定向克隆到山羊β-乳球蛋白信号肽编码序列之后。再将含有CMV、山羊β-乳球蛋白信号肽编码序列、t-PA以及SV40p(A)序列的基因片段,克隆到实验室已有的通用乳腺特异性表达载体BnF95中,最终构建了由山羊β-乳球蛋白基因5′、3′调控序列指导的t-PA cDNA突变体乳腺特异性表达载体pBCrt-PA。进一步用Sal I、Not I双酶切pBCrt-PA回收大小约9.8kb的转基因片段。通过电击转染法将转基因片段导入体外培养的奶山羊乳腺上皮细胞。经G418筛选三周后得到62株抗G418的阳性细胞株。提取抗G418的阳性细胞株基因组DNA,经PCR检测初步确认有22株细胞中整合了外源基因。用催乳素对PCR检测阳性细胞株进行诱导表达,收集诱导表达48h后细胞上清进行人组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)Elisa试剂盒ELISA检测。

人组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)Elisa试剂盒检测结果表明,有2株PCR检测阳性细胞株可表达t-PA突变体,但表达量相对较低,其表达水平分别为5.98ng/ml和2.35ng/ml。对于表达产物的活性、半衰期检测以及如何提高表达水平有待进一步研究。

参考文献

[1]Making recombinant proteins in animals–different systems,different applications[J]..Trends in Biotechnology,2003(9)

[2]The Use of the Uromodulin Promoter to Target Production of Recombinant Proteins into Urine of Transgenic Animals[J].Halina M.Zbikowska;;Nadia Soukhareva;;Reza Behnam;;Rosemary Chang;;Roman Drews;;Henryk Lubon;;David Hammond;;Serguei Soukharev.Transgenic Research,2002(4)

[3]Understanding the art of producing protein and nonprotein molecules in Escherichia coli[J].Paulina Balbás.Molecular Biotechnology,2001(3)

[4]Expression of recombinant human granulocyte macrophage-colony stimulating factor(hGM-CSF)in mouse urine[J].Zae-Young Ryoo;;Myung-Ok Kim;;Kyoung-Eun Kim;;Young Yil Bahk;;Jung-Woong Lee;;Sun-Hee Park;;Jin-Hoi Kim;;Sung June Byun;;Ha-Young Hwang;;Jeehee Youn;;Tae Yoon Kim.Transgenic Research,2001(3)

[5]周咏松.组织型纤溶酶原激活剂（t-PA）突变体乳腺特异性表达载体的构建及其细胞表达研究[D].扬州大学,2008.