荧光定量PCR引物的应用

背景^[1-4]

荧光定量PCR引物是指在荧光定量PCR核苷酸聚合作用起始时，刺激合成的一种具有特定核苷酸序列的大分子，与反应物以共价键形式连接，这样的分子称为引物。引物通常是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与靶区域一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与靶区域另一端的另一条DNA模板链互补，其功能是作为核苷酸聚合作用的起始点，核酸聚合酶可由其3端开始合成新的核酸链。

体外人工设计的引物被广泛用于聚合酶链反应、测序和探针合成等。

引物是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与目的基因一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与目的基因另一端的另一条DNA模板链互补。在PCR（聚合酶链式反应）技术中，已知一段目的基因的核苷酸序列，根据这一序列合成引物，利用PCR扩增技术，目的基因DNA受热变性后解链为单链，引物与单链相应互补序列结合，然后在DNA聚合酶作用下进行延伸，如此重复循环，延伸后得到的产物同样可以和引物结合。

荧光定量PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团，通过荧光信号不断累积而实现实时监测PCR全程，然后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。在实时荧光定量PCR中，对全程PCR扩增过程进行实时检测，根据反应时间和荧光信号的变化可以绘制成一条曲线。

实时荧光定量常用的荧光化学分类有SYBR Green I法和Tag Man探针法。

①SYBR Green I法：SYBR Green I是一种具有绿色激发波长的染料，吸收波长约为497 nm，发射波长约为520 nm，可以和所有的dsDNA双螺旋小沟区域结合。因为在游离状态下SYBR Green I发出的荧光较弱，但是当它与双链DNA结合后，荧光就会大大增强，而且荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。此法的优点是它可以监测任何dsDNA序列的扩增，检测方法较为简单，成本较低，但也正是由于荧光染料能和任何dsDNA结合，如非特异性扩增产物和引物二聚体也能与染料结合而产生荧光信号，使实验产生假阳性结果，因此其特异性不如探针法。因为非特异性产物和引物二聚体的变性温度要比目标产物的低，所以可以在熔解曲线反应过程中利用软件分析仪器收集到信号进行鉴别。

②TaqMan探针法：TaqMan探针法是具有高度特异性的定量PCR技术。它的工作原理是在PCR反应体系中存在一对PCR引物和一条探针，探针的5′端标记有报告基团，3′端标记有荧光淬灭基团，探针只与模板特异结合，其结合位点在两条引物之间。当探针完整的时候，报告基团的荧光能量被淬灭基团吸收，所以仪器搜集不到信号，随着反应的进展，Taq酶遇到探针，利用3′→5′外切核酸酶的活性把探针切断，导致报告基团的荧光能量不能被淬灭基团吸收，产生了荧光信号，因此信号的强度就代表了模板DNA的拷贝数。

应用^[5][6]

用于荧光定量PCR快速检测登革1型病毒

登革病毒主要通过埃及伊蚊和白纹伊蚊等媒介昆虫传播,引起登革热以及发病率和死亡率很高的登革出血热和登革休克综合征。登革病毒病流行于热带和亚热带地区,每年约有5000万至1亿人感染,是一种分布广、发病多、危害较大的人类传染病,已成为全球公共卫生关注的焦点之一。

随着分子生物学技术的飞速发展,实时荧光定量PCR技术在生物学研究中的应用越来越广泛。实时荧光定量PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。它在常规PCR基础上添加了荧光染料或荧光探针。荧光染料能特异性掺入DNA双链,发出荧光信号,而不掺入双链中的染料分子不发出荧光信号,从而保证荧光信号的增加与PCR产物增加完全同步。荧光探针法是将荧光共振能量传递技术应用于常规PCR中,在探针的5,端标记一个荧光报告基团(R),3,端标记一个淬灭基团(Q),两者可构成能量传递结构,即5,端荧光基团所发出的荧光可被淬灭基团吸收或抑制；当两者距离较远时,抑制作用消失,报告基团荧光信号增强,荧光监测系统可接收到荧光信号。

利用以上荧光产生原理,在PCR过程中可以连续不断地检测反应体系中荧光信号的变化。当信号增强到某一域值(PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号,域值的缺省设置为3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍)时,Ct值被记录下来。C代表Cycle,t代表threshold,Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。在这一技术的发展过程中,两个重要的发现起着关键的作用。

参考文献

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[5]Dengue Epidemiology:Virus Epidemiology,Ecology,And Emergence[J].Stephen J Thomas,Daniel Strickman,David W Vaughn.Advances in Virus Research.2003

[6]熊建英.荧光定量PCR快速检测登革1型病毒[D].南方医科大学,2012.