胰蛋白酶分离纯化方法

背景及概述^[1][2]

胰蛋白酶(Trypsin)系从哺乳类动物胰脏制得的蛋白质水解酶。结晶胰蛋白酶系从牛胰脏提取物中结晶而得，为白至黄色结晶或无定形粉末。临床用于液化血块和积脓，消化纤维沉积和坏死组织、净化创面，有利于新生肉芽的生长，促进愈合。气雾给药能液化粘痰。血清中含有非特异性的胰蛋白酶抑制剂，故不损伤正常组织。本品能增加大分子对组织的渗透性，故与抗生素或磺胺类药物合用治疗各种炎症、脓肿、溃疡、纤维素粘连等效果更显著。

分离纯化方法^[4]

将胰蛋白酶粗品溶解后，经盐溶、盐析，再用活性胰蛋白酶激活，被激活的酶溶液再经结晶透析、冻干的方法，即可得较高纯度的胰蛋白酶，包括如下步骤：

（1）投料：称取胰蛋白酶粗品，按每克胰蛋白酶粗品加2～4ml的水搅拌溶解，调节pH至3.0±0.5，以助其溶解，搅拌10～16小时；计量溶液体积，按400～500g/L比例加入固体硫酸铵，待其溶解后，静置沉淀10～16小时；

（2）盐溶：将溶液过滤，称量滤饼重量，先按每克滤饼加入2~4ml的水，搅拌溶解后，调节pH至3.0±0.4，再按每克滤饼加入1～3ml的饱和硫酸铵溶液静止沉淀10～16小时；

（3）盐析：将溶液过滤，量取滤液体积，加入等体积量的饱和硫酸铵溶液，静置沉淀10～16小时；

（4）洗镁：将上清液弃去，沉淀物真空抽滤，并在滤饼上加入饱和硫酸镁溶液，静置1分钟，抽滤，待滤液开始流出，将漏斗上剩余的硫酸镁溶液倾去，将滤饼取出称重，待活化；

（5）活化：称滤饼重量为A千克，将滤饼溶于3A～5A升的0.001～0.01mol/L盐酸溶液，另加入0.5～2mol/L氯化钙溶液A～3A升及pH7.5～8.5硼酸缓冲液4A～6A升，再加入6A～9A升的水，调节pH至7.0～8.0，最后每克滤饼加5～15mg的结晶胰蛋白酶进行活化，将溶液置0～10℃中静置60～80小时进行活化，pH控制在7.0～8.0；

（6）除钙：活化后的溶液，调节pH至3.0±0.4，再按200～300g/L加入固体硫酸铵，搅拌溶解，在0～10℃中存放32～60小时使硫酸钙沉淀，过滤，滤液按150～250g/L加入固体硫酸铵，在0～10℃中静置10～14小时，过滤，得滤饼；

（7）结晶：按每克滤饼加入1～2mlpH8.0～10.0硼酸缓冲液，调节pH至8.0±0.4，搅拌均匀，再将溶液装透析袋，0～10℃时浸于外透液中，结晶3～7天；

（8）透析：取出结晶液过滤得结晶物，再按每克结晶物加入1～3ml水溶解，调节pH至3.0±0.5；将溶液透析2～4天，去除杂质，每10～14小时左右透析池换水一次，温度控制在0～10℃；

（9）冻干：取出透析液，加入少量硅藻土，抽滤，得滤液，调节pH至6.0±0.4，进冻干机冻干后得结晶胰蛋白酶成品。

临床应用^[3]

为蛋白分解 酶，能分解、液化血凝块、脓、 坏死组织及炎性渗出物等，并能促进新生肉芽的生长。用于脓胸、外科炎症、溃疡、创伤性损伤等产生的局部水肿、血肿、脓肿等，也可用于虹膜睫状体炎、视网膜炎。喷雾吸入，可治疗呼吸道疾病，与抗生素或磺胺类药物合用，疗效更为显著。近年发现可用来治疗毒蛇咬伤，蛇毒的毒性成分为一种蛋 白质，故本品能将其分解破坏。

主要参考资料

[1] 现代药学名词手册

[2] 中国医学百科全书·十八 药物学与药理学

[3] 实用药物手册

[4] CN201510820580.3 一种分离纯化胰蛋白酶的方法及提高胰蛋白酶复溶性的药物组合物