胰蛋白酶的制备方法报道

背景及概述^[1]

胰蛋白酶原的分子量约为24000，其等电点约为pH8.9，胰蛋白酶的分子量与其酶原接近（23300），其等电点约为pH10.8，最适pH7.6～8.0，在pH=3时最稳定，低于此pH时，胰蛋白酶易变性，在pH>5时易自溶；Ca²⁺离子对胰蛋白酶有稳定作用。

胰蛋白酶能催化蛋白质的水解，对于由碱性氨基酸（精氨酸、赖氨酸）的羧基与其他氨基酸的氨基所形成的键具有高度的专一性。此外还能催化由碱性氨基酸和羧基形成的酰胺键或酯键，其高度专一性仍表现为对碱性氨基酸一端的选择。

胰蛋白酶作为蛋白酶的一种，不仅起消化酶的作用，而且还能限制分解糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其它酶的前体，起活化作用。是特异性最强的蛋白酶，在决定蛋白质的氨基酸排列中，它成为不可缺少的工具。

此外还有抗炎症作用。临床上用于脓胸、血胸、外科炎症、溃疡、创伤性损伤、瘘管等所产生的局部水肿、血肿及脓肿等。还可用于治疗毒蛇咬伤，也常用于动物细胞培养前对组织的处理。

制备^[2]

1、胰蛋白酶粗制生产操作：

1.提取工序：

1.1新鲜的胰脏，用镊子和剪刀将脂肪结缔组织等除去，置绞碎机中绞碎，称重15Kg；

1.2绞碎物置塑料桶中，用0.125mol/L硫酸溶液30L浸渍24小时，在浸渍期中每小时搅拌1次；

1.3将浸渍物置滤袋过滤，滤渣再用0.125mol/L硫酸溶液15L浸渍1小时，滤干后弃去滤渣；

2.盐溶、盐析工序：

2.1将两次浸渍液合并，体积为44.9L，置塑料桶中，每1000ml溶液中加入固体硫酸铵242g，达到40%饱和度，共加10.866Kg固体硫酸铵，静置12小时；

2.2过滤，留取过滤液，滤液体积为44L，固体弃去；

2.3在每1000ml清液中加入固体硫酸铵205g，达到70%饱和度，共用硫酸铵9.020kg，静置12小时；

2.4过滤，留取滤饼，称重269.2g，弃滤液；

2.5用807.6ml水溶解，再按2.1、2.2、2.3、2.4步骤分次加固体硫酸铵近40%和70%饱和度沉淀；

2.6取70%饱和度沉淀物，称重178.5g，用267.8ml水溶解，加入89.3ml饱和硫酸铵溶液，并用5mol/L氢氧化钠溶液调节pH至5.00；

2.7将溶液静置25℃恒温箱中48小时，有针状的糜蛋白酶粗品结晶析出；

2.8过滤，母液用0.25mol/L硫酸调节pH至3.0，其体积为328.4ml加入硫酸铵100.8g，静置12小时；

3.干燥工序：

取沉淀物，置真空干燥箱内干燥，即得胰蛋白酶粗品，称重100.0g，即每千克胰脏可得6.67克胰蛋白酶.

2、胰蛋白酶精制生产操作：

1.投料

1.1称取胰蛋白酶粗品100.0g，先用300ml纯化水搅拌溶解，加2.5mol/L硫酸溶液调节pH至3.0，以助其溶解，搅拌12小时；

1.2计量溶液体积298.4ml，加入固体硫酸铵140.9g，待其溶解后，静置沉淀12小时；

1.3将溶液真空过滤，称量滤饼重量96.6g，加纯化水289.9ml，搅拌溶解后加2.5mol/L硫酸溶液调节pH至3.0，加入饱和硫酸铵溶液193.2ml，静止沉淀12小时；

1.4将溶液过滤，量取滤液体积479.3ml，加入饱和硫酸铵溶液479.3ml，静置沉淀12小时；

1.5洗镁：将上清液弃去，沉淀物真空抽滤，并在滤饼上加入饱和硫酸镁溶液，静置1分钟，抽滤，待滤液开始流出，将漏斗上剩余的硫酸镁溶液倾去，将滤饼取出称重93.3g，待活化；

2.活化

将滤饼溶于373.2ml0.005mol/L盐酸溶液，另加入1mol/L氯化钙溶液186.6ml及pH8.0硼酸缓冲液466.5ml，再加入746.4ml纯化水，调节pH至7.4，最后加933mg活力较高的结晶胰蛋白酶进行活化处理，将溶液在5～10℃中静置72小时进行活化，第二天测pH值为7.4；

3.除钙

活化后的溶液用2.5mol/L硫酸溶液调节pH至3.1，溶液体积为1873ml，再加入固体硫酸铵455.2g，搅拌溶解，在0～10℃中存放48小时使硫酸钙沉淀，过滤，滤液加入固体硫酸铵369.0g，在 0～10℃静置12小时，过滤，得滤饼重量45.6g；

4.结晶

滤饼加入pH9.0硼酸缓冲液68.4ml，用2.5mol/L硫酸溶液调节pH至8.0，搅拌均匀，再将溶液装透析袋，5～10℃浸于外透液中，结晶5天，每2小时摇包一次；

5.透析

取出结晶液过滤得结晶物28.7g，加纯化水43.1ml溶解，用2.5mol/L硫酸调节pH至3.0；将溶液装透析袋，然后挂于透析池中透析3天，去除盐类杂质，每12小时左右透析池换水一次，温度控制在5～10℃；

6.冻干

取出透析液，加入少量硅藻土，用布氏漏斗抽滤，得滤液，用5mol/L氢氧化钠溶液调节pH至6.0，进冻干机冻干后得结晶胰蛋白酶成品6.2g，经测定其活性效价为2600iu/mg；

参考文献

[1] [中国发明] CN201410819332.2 一种分离纯化胰蛋白酶的方法及含有胰蛋白酶的药物组合物

[2] [中国发明] CN201410819906.6 一种胰蛋白酶的制备方法及含有胰蛋白酶的药物组合物