PTGER2抗体的应用

背景^[1-3]

PTGER2抗体是一种可以特异性结合PTGER2的人工合成抗体，可以靶向结合人、小鼠、大鼠和猪样品中的PTGER2蛋白。PTGER2抗体可用于多种科学应用，包括Western Blot、免疫组织化学、免疫细胞化学、免疫沉淀和ELISA。

PTGER2抗体

PTGER2抗体使用步骤（Western Blot）：

1.样本制备

1）融解RIPA裂解液（RIPA裂解液-细胞/组织裂解液缓冲液），混匀。

2）贴壁细胞：去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。

3）充分裂解后，10000-14000g离心3-5min，取上清，即可进行后续的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。

2.蛋白电泳

1）取出预制胶，将预制胶固定在电泳槽中，内槽加满tris-glycine电泳缓冲液。

2）在室温或不超过37℃的水浴中溶解5XSDS-PAGE上样缓冲液。水浴溶解后立即室温存放。

3）混合蛋白样品和5XSDS-PAGE蛋白上样缓冲液。

4）100℃或沸水浴加热3-5min，以充分变性蛋白，之后冷却至室温备用。

5）上样蛋白，并在1个孔中上样蛋白marker，盖上电泳槽盖，打开电源，电泳至蓝色染料到达胶的底端处附近即可停止电泳。

6）电泳后取出胶板，用刀在侧边硅胶处，沿着两片玻璃缝隙切开硅胶，即可打开玻璃板；取胶时。

3.转膜与封闭

1）将胶浸于预冷的转膜缓冲液中平衡5min。

2）依据胶的大小剪取膜和滤纸6片，放入预冷的转膜缓冲液中平衡10min，如用PVDF膜，需参照说明书，先用纯甲醇浸泡1-2min，再孵育于预冷的转膜缓冲液中。

3）装配转移三明治：海绵/3层滤纸/胶/膜/3层滤纸/海绵，每层放好后，用试管赶尽气泡。

4）将转移槽置于冰浴中，放入三明治，膜靠近阳极，胶靠近阴极，加入转移缓冲液，插上电极，100V，1h（电流约为0.3A）。

5）转膜结束后，切断电源，取出膜。

6）将膜浸没在5mL丽春红染色液中，置于轨道摇床上室温染色5~10min或更长，直待膜上显示出蛋白条带。

7）清洗：取出膜，用蒸馏水，PBS或者其他适当溶液冲洗至背景清晰后拍照，大概冲洗2~3次，每次5min。

8）脱色：将膜放到0.1N NaOH溶液漂洗5min；倒去洗脱液，再重复一次。

9）清洗：再用蒸馏水清洗膜2~3次，每次5min。

10）将膜置于25mL封闭缓冲液中，在室温下孵育1小时。

11）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。

4.抗体孵育与检测

1）将膜和一抗（PTGER2抗体按照产品应用推荐稀释度）置于10mL一抗稀释缓冲液中在4℃下孵育过夜并不时轻轻晃动。

2）用5mL TBST洗涤三次，每次15min以去除残留的一抗(PTGER2抗体)。

3）将膜和二抗（按照产品应用推荐稀释度）置于10mL封闭缓冲液中孵育1-2小时并不时轻轻晃动。

4）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。

5）最后一次洗膜的同时，按照ECL超敏试剂盒说明书，新鲜配制发光工作液。

6）用平头镊取出膜，搭在滤纸上沥干洗液。将膜完全浸入发光工作液中，与发光工作液充分接触。室温孵育3min，准备立即压片曝光。但勿洗去发光液。

7）显影曝光。

应用^[4][5]

PTGER2抗体可以用于肿瘤微环境中性粒细胞通过PGE2/PTGER2通路调控甲状腺未分化癌转移的机制研究

在中性粒细胞作用下,利用Transwell实验筛选出中性粒细胞相关的高迁移ATC细胞(neutrophils assotiated high-migration ATC cells,NAHMC),以及中性粒细胞不能诱导迁移的ATC细胞亚群(not-migrated cells,NMC);转录组测序挑选出差异表达的膜受体基因;Western blot、Real-time PCR检测验证差异基因在NAHMC和NMC单克隆细胞株中的表达,以及PTGER2抗体免疫组化检测差异蛋白在ATC、PTC及正常甲状腺组织的表达;Transwell实验、划痕实验、平板克隆、CCK8实验检测敲低PTGER2表达及PTGER2受体拮抗剂作用后中性粒细胞对ATC细胞的迁移和增殖能力影响;构建稳定敲除PTGER2的ATC细胞并通过Western blot实验验证敲除效率;裸鼠动物实验中,利用小动物成像系统检测敲除PTGER2对ATC淋巴结转移的影响。

PTGER2抗体ELISA检测ATC细胞上清作用中性粒细胞后前列腺素PGE2浓度的改变;Transwell实验、划痕实验、平板克隆、CCK8实验检测PGE2对ATC细胞迁移和增殖能力的影响;Western blot、Real-time PCR检测PGE2作用ATC细胞后上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)相关蛋白及mRNA的表达;相关通路抑制剂作用细胞及Transwell实验验证PGE2激活ATC细胞相关信号通路进而促进ATC细胞迁移。

TIMER数据库检索甲状腺癌中PTGER2表达与免疫细胞浸润程度、CXCL1表达与免疫细胞浸润程度、PTGER2与CXCL1表达的相关性;细胞因子芯片及ELISA检测NAHMC与NMC单克隆细胞、NAHMC与中性粒细胞共培养后的上清中细胞因子相对定量分析;PTGER2抗体ELISA及Real-time PCR检测敲低PTGER2、PGE2刺激或相关通路抑制剂作用ATC细胞后CXCL1的蛋白及mRNA表达。

[结果]组织切片HE染色显微镜下发现,ATC组织中有大量的中性粒细胞浸润。免疫组化也证实CD66b在ATC组织中高表达,然而PTC(papillary thyroid carcinoma,PTC)组织及正常甲状腺组织却较少中性粒细胞浸润及CD66b表达;Transwell实验检测发现中性粒细胞与ATC细胞无论是直接还是间接共培养,均能促进ATC细胞的迁移能力。转录组测序发现NAHMC中前列腺素受体PTGER2表达显著高于NMC;Real-time PCR、PTGER2抗体Western blot及免疫组化结果提示ATC细胞的PTGER2 mRNA和蛋白的表达高于PTC及正常甲状腺上皮细胞;敲低ATC细胞PTGER2表达以及PTGER2拮抗剂(PF-04418948)预处理细胞后,中性粒细胞促进ATC细胞的迁移能力显著下降,同时发现PF-04418948并不影响细胞活力;PTGER4抑制剂(E7046)和PTGFR抑制剂(AL-8810)对ATC细胞迁移能力无明显影响;裸鼠移植瘤动物实验中,小动物成像系统结果提示敲除PTGER2显著抑制ATC细胞淋巴结转移。

参考文献

[1]LAMC1 upregulation via TGFβinduces inflammatory cancer-associated fibroblasts in esophageal squamous cell carcinoma via NF-κB-CXCL1-STAT3.[J].Fang Lingling;Che Yun;Zhang Chaoqi;Huang Jianbing;Lei Yuanyuan;Lu Zhiliang;Sun Nan;He Jie.Molecular oncology.2021

[2]Cancer-associated fibroblasts induce monocytic myeloid-derived suppressor cell generation via IL-6/exosomal miR-21-activated STAT3 signaling to promote cisplatin resistance in esophageal squamous cell carcinoma.[J].Zhao Qitai;Huang Lan;Qin Guohui;Qiao Yamin;Ren Feifei;Shen Chunyi;Wang Shumin;Liu Shasha;Lian Jinyao;Wang Dan;Yu Weina;Zhang Yi.Cancer letters.2021

[3]CC and CXC chemokines play key roles in the development of polyomaviruses related pathological conditions[J].Mohammadi Mohammad Hassan;Kariminik Ashraf.Virology Journal.2021

[4]Pretreatment Neutrophil-to-Lymphocyte Ratio Combined with Platelet-to-Lymphocyte Ratio as a Predictor of Survival Outcomes after Definitive Concurrent Chemoradiotherapy for Cervical Cancer[J].Lee Jeong Won;Seol Ki Ho.Journal of Clinical Medicine.2021

[5]钟兆铭.肿瘤微环境中性粒细胞通过PGE2/PTGER2通路调控甲状腺未分化癌转移的机制研究[D].昆明医科大学,2021.