脐动脉内皮细胞的相关研究

背景及概述^[1-3]

内皮细胞系指血管、淋巴管的内膜上皮将内腔面覆盖的细胞。多数是单层扁平上皮属中胎叶性的上皮。血液循环和组织中大单核的游走的吞噬细胞有人认为是来自增生的血管内皮。小鼠淋巴管内皮细胞分离自淋巴管组织；淋巴管由毛细淋巴管汇合而成。其形态结构与静脉相似，但管径较细，管壁较薄，瓣膜较多且发达，外形呈串珠状。脐动脉由髂内动脉发出(主动脉※髂总动脉※髂内动脉)，与易发生动脉粥样硬化的主动脉具有极高的同源性。在难以获得人主动脉的情况下，人脐动脉是十分合适的研究材料。但是，脐动脉内皮细胞较之脐静脉内皮细胞或动物血管内皮细胞而言，不易取材及原代培养，所以文献中多采用脐静脉内皮细胞，动物血管内皮细胞，甚至转化细胞株代替。有实验采用胶原酶灌注消化法对内皮细胞进行分离纯化，并用I型鼠尾胶原蛋白包被细胞培养板，明显促进了内皮细胞的贴壁和生长。

脐动脉内皮细胞培养^[3]　

1. 培养基及胶原酶溶液的制备：M199基础培养基，添加200mL/L胎牛血清、5ng/mL成纤维细胞生长因子(fibroblastgrowthfactor，FGF)、肝素钠、青霉素、链霉素等添加剂。配制0.1g/L的胶原酶溶液，用不含Ca2+、Mg2+的Hanks液加1型胶原酶，0.22μm滤膜滤过除菌，置37℃待用。1.2.2脐动脉内皮细胞的分离无菌条件下取出脐带，在生物安全柜内剪去钳痕和凝血块阻塞部分，剪成8～10cm一段，在脐带一端剥离暴露出其中1条脐动脉，用特制针头(可用小鼠灌胃针头代替)轻轻插入脐动脉断端，可反复操作至针头大部分进入动脉管腔，结扎固定针体，用20mL一次性注射器吸取PBS后连接针头，反复灌流冲洗脐动脉2遍，将管腔内残血冲洗干净，然后注入37℃预热的1型胶原酶溶液，待血管出口处有溶液流出时，用止血钳夹闭出液端，使血管腔充盈饱满后，将其置入37℃培养箱中，消化15min。清洗和灌注时不要用力过大，否则消化液会冲破血管壁，进入组织间隙。取出消化好的脐带，沿夹闭端止血钳内侧剪断脐带，收集脐动脉内的消化酶溶液，然后注入PBS再次冲洗动脉管腔，以获得更多的内皮细胞，将消化后的酶溶液和冲洗液一并注入50mL离心管，1200r/min，离心5min，弃去上清，加入M199培养基打散细胞制成细胞悬液。

2. 脐动脉内皮细胞培养：用0.02μL/mL的鼠尾胶原预包被细胞培养瓶37℃，30min，接种细胞前吸去包被液。将细胞悬液按(1～3)×105个细胞接种于25cm2的培养瓶，置于37℃、50mL/LCO2条件下培养，1h后即可观察到有部分细胞贴壁，12h时后更换培养基去除未贴壁细胞，2～3d换液1次，至细胞刚好融合时传代。弃去培养瓶中的培养基，用PBS清洗1次，然后加入1mL含0.02g/LEDTA的0.5g/L胰蛋白酶消化液，37℃，5～8min，待细胞回缩变圆、浮起后加入M199培养液终止消化，用吸管轻轻吹打混匀，收集细胞悬液，1200r/min，离心5min，弃去上清，用M199培养液重悬细胞按1∶3比例接种传代，每次传代时密度不可太低，传代后2d左右细胞进入对数增长期，增殖较快，3～4d即可再次传代，1条脐动脉分离的脐动脉内皮细胞经过2次传代可获得(6～8)×106的细胞。

3. 脐动脉内皮细胞的形态学鉴定：利用倒置相差显微镜观察活体细胞的形态特点。

4. 免疫荧光染色检测培养：细胞的CD31表达在6孔板内放置无菌盖玻片22 mm×22mm，将内皮细胞悬液和对照细胞接种于盖玻片上，待细胞长至融合时，吸去培养液，用PBS清洗盖玻片，加入甲醛溶液固定15min，用PBS冲洗，再加入含有BSA和Tween-20的PBS溶液室温孵育1h，PBS冲洗3次，在盖玻片上滴加小鼠抗人CD31抗体工作液，另一盖玻片滴加IgG工作液作阴性对照，放入湿盒内，室温孵育1h。用PBS冲洗3次，每次10min，滴加Alexafluor488标记的抗小鼠IgG，室温孵育30min，用PBS冲洗3次，每次10min，用DAPI工作液复染细胞核，封片后荧光显微镜下观察结果。

5. 脐动脉内皮细胞管状结构形成试验：在48孔细胞培养板内加入预冷的Matrigel胶，200μL/孔，放置37℃，30min，使之凝固。将脐动脉内皮细胞和人胚肾293A细胞，分别按(6～8)×104/mL的密度重悬在M199培养基中，取出48孔板加入细胞悬液200μL/孔，置于CO2培养箱中。3h左右观察并记录形成管状结构情况，人胚肾293A细胞作为对照。

6. 结果

1）内皮细胞的形态学观察：倒置相差显微镜下观察，分离培养的细胞为单层生长，呈铺路石样镶嵌排列(图1A)。原代培养时，接种于培养瓶后1h左右开始贴壁。最初细胞呈椭圆形，后逐渐伸展呈菱形，胞质丰富，胞核清晰可见，为圆形或椭圆形，细胞间可见相互连接。3～4d后，细胞基本融合。传代细胞较原代细胞生长旺盛，有时可见多核细胞(图1B)。

2）内皮细胞特异性：膜蛋白CD31的表达荧光显微镜下可见内皮细胞胞膜呈特异性绿色荧光，细胞核DAPI染色为蓝色。脐动脉内皮细胞免疫荧光染色的结果显示小鼠IgG呈阴性(图2A)，特异性膜蛋白CD31呈阳性，且表达部位集中于细胞膜和细胞连接处(图2B)。该染色结果和表达水平与阳性对照组(HUVEC)相类似(图2C、D)，而阴性对照组(HepG2人肝癌细胞)CD31无表达(图2E、F)，说明该阳性染色细胞为脐动脉内皮细胞。

3）血管内皮细胞管状结构形成实验：脐动脉内皮细胞在基质胶表面呈浸润生长、伸展，逐渐变形呈梭形，相互缓慢连接，形成大小不一的管腔样结构(图3A、B)，对照组293A细胞呈圆球状分散分布，无管状结构形成(图3C、D)。

相关研究^[4-5]

有实验探讨妊高征脐血管内皮细胞损伤与内皮素(ET)、一氧化氮(NO)释放和一氧化氮合酶(NOS)活性的关系。方法：用内皮细胞铺片法结合免疫组化技术观察内皮细胞损伤程度和内皮细胞中ET阳性率；用Criess法检测血浆中NO代谢产物亚硝酸基和硝酸基(NO-2/NO-3)浓度，同时测定脐血管组织NOS活性。结果：妊高征组脐血管内皮细胞损伤程度、ET阳性率明显高于对照组(P<0.01)；血浆NO/NO浓度和脐血管NOS活性显著低于正常对照组(P<0.01)。结论：妊高征患者脐血管内皮细胞损伤加重，ET、NO和NOS代谢异常，导致血管舒缩功能障碍，可能是妊高征重要的发病机理。

此外，有实验用细胞化学方法研究了体外培养人脐动脉内皮细胞的Ｍｇ－ＡＴＰ酶及碱性磷酸酶活性，并与人脐带切片中血管内皮以及大鼠脑、心、肾及肝等切片中血管内皮有关酶相比较。同时，用免疫细胞化学方法检查了培养脐动脉内皮细胞的Ⅷ因子相关抗原。结果显示∶1）培养４８及７２ｈ的脐动脉内皮细胞、人脐带血管及大鼠脑、心、肾、肝血管内皮都呈Ｍｇ－ＡＴＰ酶阳性。2）碱性磷酸酶在上述各标本的血管内皮均呈阴性反应。3）培养的人脐动脉内皮细胞呈Ⅷ因子相关抗原阳性。以上结果提示∶1）体外培养人脐动脉内皮细胞和体内重要器官血管内皮的功能有相似性，是一种较为理想的研究人类动脉血管内皮生理功能和疾病的细胞模型。2）Ｍｇ－ＡＴＰ酶可作为脐血管内皮以及脑、心、肾、肝等器官血管内皮的标志酶之一。

主要参考资料

[1] 现代药学名词手册

[2] 一种高效分离和培养人脐动脉内皮细胞方法的建立

[3]人脐动脉内皮细胞-平滑肌细胞共培养模型的建立及鉴定

[4] 妊高征脐动脉内皮细胞损伤与内皮素和NO合酶的变化及意义

[5] 培养人脐动脉内皮细胞的组织化学和免疫细胞化学的研究