RAT IL-2 ELISA KIT的应用

背景^[1-3]

RAT IL-2 ELISA KIT即大鼠白细胞介素2酶联免疫吸附检测试剂盒，是一种用于特异性地高灵敏地定量检测大鼠血清、血浆或细胞培养上清液中的IL-2的ELISA试剂盒。

RAT IL-2 ELISA KIT采用双抗体夹心酶联免疫吸附检测技术。特异性抗大鼠IL-2抗体预包被在高亲和力的酶标板上。酶标板孔中加入标准品、待测样本和生物素化的检测抗体，经过孵育，样本中存在的IL-2与固相抗体和检测抗体结合，形成免疫复合物。洗涤去除未结合的物质后，加入辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(Streptavidin-HRP)。洗涤后，加入显色底物，避光显色。加入终止液终止反应，在450nm波长（参考校正波长540nm或570nm）测定吸光度值。

RAT IL-2 ELISA KIT

RAT IL-2 ELISA KIT检测程序一般如下：

实验开始前，各试剂均应平衡至室温（试剂不能直接在37℃溶解）；试剂或样品稀释时，均需混匀，混匀时尽量避免起泡。实验前应预测样品含量，如样品浓度过高时，应对样品进行稀释，以使稀释后的样品符合试剂盒的检测范围，计算时再乘以相应的稀释倍数。

1.加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100μl，余孔分别加标准品或待测样品100μl，注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37℃反应120分钟。为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。

2.弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加检测溶液A工作液100μl（在使用前一小时内配制），酶标板加上覆膜,37℃反应60分钟。

3.温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分钟，大约400μl/每孔，甩干（也可轻拍将孔内液体拍干）。

4.每孔加检测溶液B工作液（同检测A工作液）100μl，酶标板加上覆膜37℃反应60分钟。

5.温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分钟，350μl/每孔，甩干（也可轻拍将孔内液体拍干）。

6.依序每孔加底物溶液90μl，酶标板加上覆膜37℃避光显色（30分钟内，此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度兰色，后3-4孔梯度不明显，即可终止）。

7.依序每孔加终止溶液50μl，终止反应，此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性，底物反应时间到后应尽快加入终止液。

8.用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度（OD值）。在加终止液后立即进行检测。

应用^[4][5]

RAT IL-2 ELISA KIT可以用于泻火补肾汤对脑出血神经干细胞移植后免疫排异中IL-2、IL-10表达的影响

通过观察泻火补肾汤对白介素-2(interleukin2,IL-2)和白介素-10(IL-10)在NSC移植后脑出血大鼠脑内及IFN-γ干预大鼠脑微血管内皮细胞(rat cerebral microvascular endothelial cells,RCMECs)中的表达的影响,探讨泻火补肾汤在NSC移植免疫反应中对微血管内皮细胞的保护作用及可能机制。

方法1.大鼠随机分为正常组、假手术组、脑出血组、NSC移植组及泻火补肾汤组,Ⅶ型胶原酶注射复制脑出血模型,术后2 d进行NsC移植,第4 d,7 d分两批处死,分别用Western blot及RAT IL-2 ELISA KIT观察大鼠脑组织及外周血IL-2、IL-10和蛋白表达的变化,用TUNEL观察细胞凋亡情况。2.分离原代鼠脑微血管内皮细胞,随机分为空白组、IFN-γ刺激组、正常血清对照组、泻火补肾汤组,IFN-γ干预4h后分别用正常血清、舍泻火补肾汤血清孵育4h。用RT-PCR及RAT IL-2 ELISA KIT观察IL-2、IL-10mRNA和蛋白表达水平,用TUNEL观察细胞凋亡情况。

结果体内实验1.脑出血进行侧脑室下区神经于细胞移植治疗的最佳治疗时间是出血后第2天。2.在正常鼠脑中,未见TUNEL阳性细胞。脑出血后可见较多TUNEL阳性细胞,主要分布于出血区周围,NSC移植后4天、7天TUNEL阳性细胞表达增加,与脑出血组比较差异显著(P＜0.05);泻火补肾汤干预后阳性细胞较NSC移植组明显减少(P＜0.05),神经干细胞移植后各组7d较4d细胞凋亡减少。3.IL-2的检测:(1)RAT IL-2 ELISA KIT检测血清中IL-2蛋白表达:4天时,正常组、假手术组血清IL-2有轻度表达,脑出血组、NSC移植组血清IL-2水平较正常组和假手术组明显上升,泻火补肾汤组血清IL-2水平低于脑出血组及NSC移植组:7天时,脑出血组、NSC移植组、泻火补肾汤血清IL-2水平较4d表达减少,NSC移植组IL-2表达水平最高,泻火补肾汤组血清IL-2水平低于脑出血组及NSC移植组。(2)Western bolt检测脑内IL-2蛋白表达:4天时,正常组、假手术组IL-2有轻度表达,脑出血组、NSC移植组、泻火补肾汤组IL-2水平较正常组和假手术组明显上升,NSC移植组表达最强,泻火补肾汤组IL-2表达较NSC移植组减少;7天时各组表达差异比较同4天,各组与4天比较表达减轻,但无统计学差异。

体外实验:1.IFN-γ刺激脑微血管内皮细胞模拟免疫损伤模型,确定IFN-γ刺激浓度最佳为40ng/ml,5%泻火补肾汤血清作用4h作为最佳的干预条件。2.IL-2的检测:(1)RAT IL-2 ELISA KIT检测细胞上清中IL-2蛋白表达:IFN-γ刺激后,IFN-γ组、正常血清组、泻火补肾汤组细胞上清IL-2较空白对照组表达增加,泻火补肾汤干预后与IFN-γ组、正常血清组比较IL-2表达减少。(2)RT-PCR检测结果显示:IL-2:空白组大鼠脑微血管内皮细IL-2mRNA表达;IFN-γ干预后,IL-2mRNA表达显著增加;正常血清组较IFN-γ刺激组显著减少;泻火补肾汤血清孵育后IL-2mRNA表达较正常血清组明显降低。

参考文献

[1]Reduced Oxidative Stress Promotes NF-κB-Mediated Neuroprotective Gene Expression after Transient Focal Cerebral Ischemia:Lymphocytotrophic Cytokines and Antiapoptotic Factors[J].Yun Seon Song;;Yong-Sun Lee;;Purnima Narasimhan;;Pak H Chan.Journal of Cerebral Blood Flow&Metabolism,2007

[2]Effective induction of immune tolerance by portal venous infusion with IL-10 gene-modified immature dendritic cells leading to prolongation of allograft survival[J].Ming Zhang;Quanxing Wang;Yushan Liu;Yanping Sun;Guoshan Ding;Zhiren Fu;Zhilian Min;Youhua Zhu;Xuetao Cao.Journal of Molecular Medicine,2004(4)

[3]Cytotoxicity of cytokines in cerebral microvascular endothelial cell[J].Hitoshi Kimura;;Ilker Gules;;Toshinari Meguro;;John H.Zhang.Brain Research,2003(1)

[4]Transplantation of neural stem cells in a rat model of stroke:assessment of short-term graft survival and acute host immunological response[J].Michel Modo;;Payam Rezaie;;Paul Heuschling;;Sara Patel;;David K Male;;Helen Hodges.Brain Research,2002(1)

[5]朱莹.泻火补肾汤对脑出血神经干细胞移植后免疫排异中IL-2、IL-10表达的影响[D].湖南中医药大学,2010.