右旋糖酐40的制备

背景及概述^[1][2]

右旋糖酐40，又叫低分子右旋糖酐，本品可提高血浆参透压而增加血浆容量。有改善微循环作用，能防止弥漫性血管内凝血，使静脉回流量和心搏出量增加，具有渗透性利尿作用。

制备^[2]

CN201410003338.2提供一种右旋糖酐酶的制备方法及其在制备低分子量右旋糖酐中的应用。 本发明提供一种从土壤中筛选出的高酶活右旋糖酐酶产生菌-棘孢青霉，该菌株保藏名称为：棘孢青霉F1008，保藏单位：中国微生物菌种保藏中心。 本发明运用棘孢青霉F1008发酵培养制得高活性的右旋糖酐酶，其制备步骤包括：

1）菌株活化：采用灭菌固体PDA培养基，将F1008菌株接种在试管斜面上，30-32℃下培养48-60h，然后用于菌株种子液制备；

2）菌株种子发酵培养：种子培养基组分为每100ml水中含有Dextran100kDa1.5g，蛋白胨0.4g，K₂HPO₄·3H₂O0.1g，NaNO₃0.2g，MgSO₄·7H₂O0.05g，KCl0.05g，FeSO₄·7H₂O0.001g，pH5.0～5.5，将步骤1）中的菌株接种到所述的种子培养基中，置于恒温摇床上30-32℃，转速220r/min下培养48-72小时作为种子液，然后将种子液用于发酵制备右旋糖酐酶；

3）发酵制备右旋糖酐酶：发酵培养基组分为每100ml水中含有Dextran100kDa1.5g，蛋白胨0.4g，K₂HPO₄·3H₂O0.1g，NaNO₃0.2g，MgSO₄·7H₂O0.05g，KCl0.05g，FeSO₄·7H₂O0.001g，pH5.0～5.5，利用灭菌后发酵培养基，将步骤2）中的种子液按5%的比例接入液体发酵培养基中，置于恒温摇床上30-32℃，转速220r/min下培养5天得到相应的右旋糖酐酶的发酵液，然后将发酵液用于分离纯化；

4）右旋糖酐酶的分离纯化：将步骤3）中得到的右旋糖酐酶的发酵液通过过滤、离心分离菌体，然后再进行硫酸铵盐析以及琼脂糖凝胶柱分离，得到纯的右旋糖酐酶酶液，运用DNS法测定酶活力。

5）右旋糖酐酶优先降解高分子右旋糖酐的特性：将步骤4）中得到的纯酶液与两种不同分子量右旋糖酐（底物E分子量Mw34242Da，底物F分子量Mw6655Da）构成的双底物溶液进行混合，在25℃下催化反应，运用HPLC检测催化过程中两种底物的分子量变化，结果见图1，高分子量的底物E优先被降解，分子量不断降低，而低分子量的底物F在反应初期基本无变化，从而证实本发明公开的棘孢青霉F1008右旋糖酐酶具有优先降解高分子右旋糖酐的特性。

本发明公开的棘孢青霉F1008能够产生高酶活性的右旋糖酐酶，该右旋糖酐酶的特征在于它的最适作用温度为25～35℃，最适催化pH为5.0～6.0，其平均酶活高于600U/mL，并且该右旋糖酐酶在多底物溶液中优先选择与高分子量的底物反应，非常适用于低分子量右旋糖酐的制备。

本发明公开棘孢青霉F1008右旋糖酐酶在制备系列低分子右旋糖酐中的应用，其方法按如下步骤进行：

按1000mL的反应体系计算，首先将60-200g的蔗糖溶解于pH5.00.02mol/L乙酸-乙酸钠缓冲溶液中，在25℃下同时添加2000-3000U的市售右旋糖酐蔗糖酶与2500-7500U的右旋糖酐酶，恒温搅拌反应22-26小时；然后将反应体系置于80℃下保温1小时灭活右旋糖酐蔗糖酶，纱布滤过变性酶蛋白后再置于沸水浴中20分钟灭活残留的右旋糖酐酶，再经真空过滤得到清澈透明的滤液，即为系列低分子右旋糖酐溶液；

最后将该溶液进行旋蒸浓缩70℃旋蒸浓缩去除部分水分，浓缩至原体积一半后进行分级醇沉，采用四级划分：一级乙醇浓度为48，得到的沉淀为残余蛋白杂质及少量高分子糖酐；二级乙醇浓度为58，得到的沉淀为10000Da的右旋糖酐；三级乙醇浓度为68，得到的沉淀物为6000-8000Da的右旋糖酐；四级乙醇浓度为78，得到的沉淀物为3000-5000Da的右旋糖酐；每级得到的沉淀置于80℃真空干燥箱中干燥4小时，即得到系列低分子右旋糖酐纯品。

本发明的优点在于：

棘孢青霉F1008发酵培养成本低，所产的右旋糖酐酶具有高酶活、高的底物特异性、多底物溶液中优先与高分子量的底物反应、能耗低等优点，在与右旋糖酐蔗糖酶组成的双酶体系中能够及时优先降解右旋糖酐蔗糖酶合成出的大分子量右旋糖酐，从而累积低分子右旋糖酐的量，非常适用于工业化运用，利用该酶与市售右旋糖酐蔗糖酶联合催化蔗糖制备系列低分子量右旋糖酐的反应条件温和、能耗低，工序简单；通过调节双酶体系的工艺参数（蔗糖浓度、双酶用量、反应时间），可以实现对右旋糖酐分子量的调控；通过后期对反应液进行的浓缩处理，醇沉过程的无水乙醇用量大大减少，从而使得生产成本进一步降低；双酶催化得到的右旋糖酐分子量分布集中、种类多（10000Da，6000-8000Da，3000-5000Da），总收率高；本发明可以实现低分子右旋糖酐生产工艺低成本化、 环保、低碳、产率提高的目标，为酶法生产右旋糖酐的工业化奠定坚实的基础。

药代动力学^[2]

平均分子量约为40000。因分子小，在体内停留时间短，易从尿中排出，故扩充血容量的作用较为短暂。

临床应用^[2]

用于急性失血性休克、心绞痛、心肌梗死，以及脑血栓形成、脑供血不足、血栓闭塞性脉管炎等。 

不良反应^[2]

①少数患者发生过敏反应：发热、寒战、胸闷、呼吸困难等;②用量超过1 000ml时，少数患者出血时间延长。

注意事项^[2]

①用药前取0.1 ml作皮内注射，观察15min;②充血性心力衰竭及其他血容量过多，有出血倾向者忌用;③肝、肾功能不全慎用。

主要参考资料

[1] 实用处方及非处方药物大全

[2] CN201410003338.2 一种右旋糖酐酶及其在制备低分子右旋糖酐中的应用