葡聚糖的几种制备方法
发布日期:2021/2/25 11:41:32
背景及概述[1]
葡聚糖，又称右旋糖酐，是指以葡萄糖为单糖组成的同型多糖。葡聚糖链长短的不同决定了其药用价值不同，长链葡聚糖通常为血容量扩充药，分子量在几万到十几万；而短链葡聚糖可以与氢氧化铁进行络合，制成葡聚糖铁，即右旋糖酐铁。
葡聚糖是蔗糖经肠膜状明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)产生的右旋糖酐蔗糖酶(dextransucraseEC2.4.1.5)催化合成的高分子葡萄糖聚合物，该聚合物含有95％的α‑1，6糖苷键，同时含有少量其他糖苷键的分支结构。因其具有安全、无毒等多种优点，已被广泛应用于医药、食品和工业等多个领域。高分子右旋糖酐可以用作药物载体，以及常用的凝胶色谱填料。临床上常用的右旋糖酐有三种规格：右旋糖酐70、右旋糖酐40及右旋糖酐20，它们主要用作血浆代用品，用于出血性休克、创伤性休克及烧伤性休克等。重均分子量6‑8kDa的右旋糖酐常被制成右旋糖酐铁，用于治疗严重的贫血症。重均分子量5kDa的右旋糖酐常被硫酸化，用于治疗血栓。低分子异麦芽糖近来被发现，可用作益生元。作为一种来源丰富的多糖，右旋糖酐是食品工业中的优良配料，主要用作保湿剂、稳定剂、增量及和增稠剂。在工业上，右旋糖酐被用作为油井钻泥的添加剂。
制备[1-2]
报道一、
发酵法结合酶法制备分子量可控的药用葡聚糖，按如下步骤进行：
(1)肠膜状明串珠菌发酵合成高分子葡聚糖，包含以下A、B两步：
A：培养基配制
种子培养基(g/L)：蔗糖100，蛋白胨2.5，Na2HPO4·12H2O1.8；发酵培养基(g/L)：葡聚糖70(1)15.0，蛋白胨5.0，K2HPO4·3H2O1.0，FeSO4·7H2O0.01，KCl0.5，MgSO4·7H2O0.5，用NaOH调pH至7.4；在0.1MPa压力下，灭菌20min。
B：肠膜状明串珠菌发酵合成高分子葡聚糖
在无菌环境下，将肠膜状明串珠菌以5.0％的接种量转接到分别装有100mL种子培养基的3个摇瓶中，于25℃，120r/min条件下培养22h。然后以5.0％的接种量转接到装有5.0L发酵培养基的发酵罐中，于25℃，120r/min条件下发酵22h。出料时，向发酵液中加入85％的乙醇使发酵液中乙醇的体积浓度为35％～38％，葡聚糖沉淀后，再经85％乙醇捏洗至“老化”。蔗糖转化率高达95％，该步骤糖酐收率在85％～90％。
(2)高分子葡聚糖的糊化
将上述步骤1)获得的750.48g湿糖酐用蒸馏水按照湿糖酐与缓冲溶液按照1∶1.8(w/V)配制成高分子葡聚糖溶液，在90度条件下保温12小时，标定高分子葡聚糖的浓度为11％时添加55.41mL蒸馏水。
(3)葡聚糖酶催化水解高分子葡聚糖
葡聚糖酶的活力测定：将4mL用蒸馏水配制的3.0％葡聚糖70kDa溶液置于35度保温10min，再加入适当稀释的葡聚糖酶液1mL保温1小时后，采用3，5‑二硝基水杨酸(DNS)法测定生成的还原糖。以上述条件下酶分钟产生1μmol还原糖(葡萄糖当量)所需要的酶量定义为一个酶活力单位(U)。检测结果所示葡聚糖酶液活力为300U/mL。
向步骤2)经浓度标定后为11％的高分子葡聚糖溶液中加入葡聚糖酶使其终浓度为0.5IU/mL，加入的葡聚糖酶总活力单位为971.5U，置于35℃条件下搅拌反应130～150min，然后采用100度水浴保温10min或通入水蒸气5min的方法，是葡聚糖酶变性失活，从而终止酶催化反应。
(4)去除杂质
将上述步骤3)经葡聚糖酶催化水解的反应液置于80℃保温30min，冷却后采用中速定性滤纸过滤，然后将上述滤液采用活性炭搅拌吸附10min后，静置10min，再利用中速定性滤纸去除活性炭等，清澈透明的滤液用于右旋糖酐分离醇沉。
(5)乙醇分级醇沉及真空干燥
采用4级划分，一级划分乙醇体的积浓度为38％，在搅拌装置下，向步骤4)所得滤液中加入缓慢体积浓度95％的乙醇，根据滤液温度和酒精度值查表的滤液中酒精的体积浓度，当乙醇的体积浓度达到39％时停止醇沉，将醇沉好的溶液置于40度保温22h后，倒出上清液，再向沉淀中加入适量乙醇，取出一级沉淀大分子杂质；二级划分乙醇的体积浓度为43％，向一级划分后的上清液缓慢加入95％的乙醇，具体操作同上，使溶液中乙醇的体积浓度达到42％时，停止醇沉，将醇沉好的溶液置于34度保温22h后，倒出上清液，再向沉淀中加入适量乙醇获得葡聚糖70产品；三级划分乙醇的体积浓度为47％，向二级划分后的上清液中缓慢加入95％的乙醇，具体操作同上，使溶液中乙醇体积浓度达到48％时停止醇沉，将醇沉好的溶液置于40度保温12h后，倒出上清液，再向沉淀中加入适量乙醇获得葡聚糖40产品；四级划分乙醇浓度为58％，向三级划分后的上清液中缓慢加入95％的乙醇，使溶液中乙醇体积浓度达到58％时停止醇沉，将醇沉好的溶液置于室温静置2h后，倒出上清液，再向沉淀中加入适量乙醇获得葡聚糖20产品。
将上述的葡聚糖产品分别置于80℃真空干燥箱中干燥4h，去除产品中残留的乙醇及水分，最后得到三种不同分子量的药用级葡聚糖，经搞笑液相色谱检测，三种产品的分子量分别是68574，39821和21053Da，保留时间分别为13.926min，14.327min和15.054min，分子量分布系数分别为1.86、1.40和1.23，酶解划分收率为85.35％，对应的产率为15.20％、60.49％和9.67％。当反应时间为130～150min，可以定向制备葡聚糖40为主要的产品。
报道二、
一种生产小分子葡聚糖的方法，具体步骤如下：
(1)将pH＝5、浓度为0.01g/L的葡聚糖酶溶液加入截留分子量为10000Da的聚丙烯腈卷式超滤膜系统中，在操作压力1.0MPa、温度30℃下进行过滤浓缩处理，使得葡聚糖酶2完全吸附在超滤膜3的表面或膜孔内；得到酶膜反应器；
(2)在步骤(1)所得酶膜反应器中加入pH＝5.5、浓度为100g/L、重均分子量为20000Da的葡聚糖原料1的溶液，在操作压力为0.6MPa，温度为50℃下进行过滤，收集透过液中的小分子葡聚糖产物4，测得其平均分子量为4500Da，分子量分布宽度指数为1.8。而在同样条件下，采用分体式酶膜反应器，葡聚糖酶6没有起到调控膜孔径的作用，葡聚糖原料5酶解后通过超滤膜7后获得小分子葡聚糖产物8，其平均分子量为5600Da，分子量分布宽度指数为2.8，与小分子葡聚糖产物4相比，分子量分布宽度指数增加，平均分子量增大。
(3)待膜通量或产率下降50％以上，将超滤系统内的料液顶出，加入0.1％的氢氧化钠溶液在40℃下清洗1小时，将超滤膜系统冲洗干净后再加入0.2％的柠檬酸清洗1小时，然后重新进行葡聚糖酶的固定化和酶解分离。与传统的分批酶解-灭活-超滤膜分离的方法相比，本方法进行葡聚糖酶解和分离获得的产率提高20％，葡聚糖酶使用量减少60％，产品纯度提高30％。
参考文献
[1][中国发明,中国发明授权]CN201310247228.6制备分子量可控的药用葡聚糖的方法
[2][中国发明]CN201711285656.2一种生产小分子葡聚糖的方法及其产品和用途
