小鼠小肠上皮细胞的鉴定和纯化

背景及概述^[1-2]

上皮细胞覆盖于身体表面并衬贴于体内空腔器官腔面的细胞。其排列有明显极性，一面朝向身体表面或腔面，称游离面；一面向着深部的结缔组织，称基底面。上皮细胞具有强大的角生和更新能力。上皮组织具有保护、吸收、分泌和排泄等作用。当上皮细胞受损时，则影响机体的防御功能。小肠上皮细胞(intestineepitheliumcells，小肠上皮细胞)是吸收营养物质的专职细胞，小肠上皮细胞的体外培养对于研究肠道微生态营养，细胞间的信号转导以及隐窝-绒毛系统中各种细胞增殖和分化机制等方面具有重要意义。

分离^[2]

无菌条件下用含抗生素的PBS(或无血清DMEM)清洗小肠数次，清洗液中的抗生素为培养液中的2～3倍。将肠管剪成小于1mm3的碎片，再转移至50mL的离心管中，加无血清DMEM清洗，用移液管反复吹打，4℃，1000r离心3min。如上反复清洗组织块，直至上清液澄清。用5%FBS-DMEM悬浮组织块并取适量种植于培养皿或培养瓶中。培养数天后换液，继续培养。

纯化^[2]

(1)刮除法：将培养瓶放在光学显微镜下观察，用标记笔勾画出上皮细胞集落。在超净台上，用橡胶或玻璃刮子(可用灭过菌的枪头)将成纤维细胞区域刮除。用PBS洗涤培养物，洗去刮下来的细胞。再用胰蛋白酶消化上皮细胞，并用新鲜的培养液重新悬浮，转移至新的培养瓶继续培养。经常观察培养物，必要时，可以重复上述的刮除处理过程，直至显微镜下观察时，视野中大部分为上皮细胞。

(2)相差消化和相差贴壁法：用PBS洗涤细胞，加入0.05%的胰蛋白酶-EDTA消化1～2min，轻轻拍打培养瓶，再将消化液吸去。再加入0.05%的上述酶溶液37℃消化2～3min，加入5%FBS-DMEM吹打，再将细胞悬液移入新的培养瓶(或培养板)继续培养。

传代^[2]

将贴壁的上皮细胞用PBS清洗两遍，弃去PBS；加入适量(25cm2的培养瓶，0.5mL)0.05%Trypsin-EDTA消化液，37℃1～2min，在倒置显微镜下观察，直至大部分细胞发亮；加入5mL5%FBS-DMEM中止胰蛋白酶的消化，并将细胞全部转移至带盖离心管中，1000rpm4℃离心5min；弃去上清液，用5%FBS-DMEM重新悬浮吹打细胞，计数，按0.5～0.8×104个/cm2的密度种植到新的培养瓶中，则传代结束。

形态学检查　

倒置显微镜下观察细胞生长状态。用台盼蓝染色，显微镜下计数活细胞，确定其生长活力。

鉴定^[2]

吸去培养液，用PBS洗涤2到3遍。用4%多聚甲醛室温固定30min蒸馏水洗；30%H2O21份+纯甲醇50份混合，室温浸泡30min，以灭活内源性过氧化物酶。蒸馏水洗3次；滴加5%BSA封闭液，室温20min。甩去多余液体，不洗；滴加适当稀释的一抗(1：50)，37℃1小时左右，PBS洗2min×3次；阴性对照组滴加等量的PBS；滴加生物素山羊抗兔IgG，20℃～37℃20min，PBS洗2min×3次；滴加试剂SABC，20℃～37℃20min，PBS洗5min×4次；DAB显色：使用DAB显色试剂盒，取1mL蒸馏水，加试剂盒中A、B、C试剂各1滴，混匀后加至切片。室温显色，镜下控制反应时间，一般在20～30min之间。

相关研究^[3-4]

有研究分析γ射线照射后，在辐射损伤期和修复期小鼠肠上皮细胞蛋白质组的改变，以探讨肠上皮细胞损伤与修复的分子机理。采用9Gy全身照射BALBc小鼠，分别于照射后3h和72h取小肠制备卷肠切片，染色并观察小肠形态。分离未照射小鼠及照射后3h和72h小鼠的肠上皮细胞，制备蛋白样品，采用双向电泳技术分离样品，PDQuest软件处理双向电泳图谱；并对差异的蛋白质点进行肽质量指纹分析。结果显示小鼠肠上皮在照射后3h以损伤性改变为主，72h后出现明显再生修复。采用双向电泳技术在正常对照组、照射后3h组以及照射后72h组分别检测到(638±39)、(566±32)和(591±29)个蛋白质点。对其中28个差异蛋白质点进行了肽质量指纹分析，经数据库检索，初步鉴定为一些与代谢、过氧化应急、信号转导相关的蛋白质。结因此电离辐射能诱导小鼠肠上皮细胞蛋白表达的改变，双向电泳技术对从整体方面揭示辐射损伤的分子机理有重要价值。

此外，还有研究探讨治疗和预防直肠癌患者围手术期放射性小肠损伤的有效方法及其机制。方法应用复制缺陷型单纯疱疹病毒(HSV)作为锰超氧化物歧化酶(MnSOD)和(或)绿色荧光蛋白(GFP)基因载体转染小鼠小肠上皮；应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)测定MnSOD在小鼠小肠上皮细胞内的表达，酶活性检测法测定MnSOD活性；全腹腔照射(0，7.5，10.0，12.5，15Gy)24h和72h后取标本，应用SZ-PT光学系统测量小肠绒毛的长度。结果MnSOD在小鼠小肠上皮细胞过度表达，酶活性检测表明，MnSOD活性显著增高，转染组MnSOD对超氧阴离子的抑制率达39.33%±0.67%。

主要参考资料

[1]儿科学辞典

[2]小鼠小肠上皮细胞的分离培养研究

[3] 小鼠小肠上皮细胞经γ射线照射后蛋白质组差异分析

[4] 锰超氧化物歧化酶基因转染小鼠小肠上皮细胞的放射损伤保护作用