安丝菌素 P 3的生产研究

简述

安丝菌素 P 3是一种隶属于属于安莎类抗生素范围的化学物质，分子式为C₃₂H₄₃ClN₂O₉，分子量为635.14，外观为白色固体粉末，具有抗肿瘤、抗结核杆菌、抗细菌等多种药理活性[1]。

根据现有的文献来看，安丝菌素 P 3主要通过微生物发酵进行生产，生产工艺属于典型的抗生素发酵工艺。目前，国内对该化合物的创新性研究很少，而国外研究很热，每年发表文献数量逐年上升。我国有四川大学、上海交大等多家单位和医药公司都在进行安丝菌素的发酵工艺开发，其组分有P-0、P-1、P-2、P-3、P-3'、P-4和P-4'，其中安丝菌素P-3为主要合成产物，他通过阻碍微管形成从而阻止细胞的有丝分裂使细胞死亡，在体外及荷瘤动物中具有显著抗肿瘤作用。

生产研究

作为理想的靶向化药物的毒性物，安丝菌素 P 3在新型抗肿瘤药物抗体偶联物研究中备受关注。2013年罗氏抗体药物偶联物Kadcyla被FDA批准用于治疗HER-2阳性晚期转移性乳腺癌。此外，还有SAR3419,BT062,BAY94-9343等多个美登素类偶联物也都处于Ⅰ～Ⅱ期临床试验阶段，取得了显著的临床效果。目前，安丝菌素 P 3发酵水平低下，且市场价格昂贵，严重限制了对其进一步药理研究及应用。因此对珍贵橙色束丝放线菌发酵过程进行优化与调控以提高A安丝菌素 P 3发酵水平具有积极的现实意义。以珍贵橙色束丝放线菌APSP-01为研究菌株，对其发酵生产安丝菌素 P 3的培养基和培养条件进行优化，并对其进行放大研究，建立发酵动力学模型，确定最佳流加培养策略得出以下结论： 采用单因素试验与均匀设计相结合的方法对化合物发酵培养基进行了优化。首先采用单因素试验法考察了培养基中碳源，有机氮源和铵盐等成分对产物产量的影响，然后采用均匀实验设计U*15(157)对其进一步进行优化，确定最佳发酵培养基组成为：葡萄糖4.22%，麦芽糖0.75%，玉米浆3.42%，乙酸铵0.41%，异丁醇0.43%。在最优培养基下进行验证试验，得到安丝菌素 P 3产量为(51.86±1.33)mg/L，与模型预测值相符，为后续实验提供了依据。至于补料策略则确定为：在发酵约84h，残糖浓度降至20g/L以下，采用恒速补料的方式补入流加培养基，在此工艺条件下，发酵216h，最终安丝菌素 P 3产量达92.24mg/L，比优化前提高了28.11%[2]。

另有文献报道[3]金属离子对微生物生长和次级代谢产物至关 重要，因金属离子添加被认为是一种简单有效的策略，但是未应用于AP-3的生产。研究以提高安丝菌素 P 3产量为目的，首先考察了不同的二价金属离子对发 酵过程的影响，筛选出效果最好的金属离子Mg²⁺。然后通过添加时间，添加浓度的优化实验确定最适发酵条件，使AP-3的产量达到了85mg/L，是对照 组的3倍。在此基础上，研究进一步分析镁离子添加对前体，酶活及生物合成基因的影响。在酶水平，测定了聚酮类抗生素生物合成过程中关键酶甲基丙二酰 CoA羧基转移酶和甲基丙二酰CoA异构酶的比活，发现它们均有不同程度的提高。同时检测到，当安丝菌素P 3产量增加时，其生物合成前体丙二酰CoA和 甲基丙二酰CoA的含量显著降低，从而确定了它们在AP 3生物合成过程中的关键作用。进一步通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法，在转录水平 跟踪AP 3生物合成相关基因的表达量的高低对镁离子的响应。数据表明，结构基因asm14，asm24和asm43，以及调节基因asm39和 asm40都是上调的，与AP 3的产量呈正相关性。研究表明添加镁离子可以提高安丝菌素 P 3产量，为其它大环内酯类抗生素的发酵生产及大规模培 养提供了参考依据。

通过应用Plackett-Burman设计和折叠Plackett-Burman设计以及单因素实验观察到异丁醇和铵离子对安丝菌素 P 3的合成过程分别具有正效应和负效应。对相关的培养基进行条件优化，观察到铵离子的去除能提高它的产量，但铵离子作为常用氮源及含氮物质的中间代谢物，往往在发酵过程中积累。因此，结合抗生素的生物合成途径并从蛋白质组学的角度研究其影响机制可为铵离子抑制的解除，后续培养基选择及代谢途径改造等提供重要信息。由此，对添加(37 mM)和不添加铵离子的发酵过程进行分析，结果表明铵离子抑制菌体生长速度，促进胞外异丁酸的代谢。从酶活性的检测数据观察到铵离子在整个发酵过程中提高缬氨酸代谢的第一个酶缬氨酸脱氢酶的活性，而不像其它抗生素发酵体系中报道的抑制作用。转录分析表明大部分产物生物合成基因的转录水平受铵离子抑制，与产量变化一致。进一步应用双向电泳考察蛋白质组的响应，在pH3-5.6且PAGE浓度为13.5%的双向电泳条件下获得约1600个蛋白质点，质谱鉴定得到12个差异表达1.5倍以上的蛋白质，包括3-磷酸-甘油醛脱氢酶(下调2倍)，脂肪酸合成酶(上调1.7倍)，及负责丝氨酸生物合成的3-磷酸甘油酸脱氢酶(上调3.9倍)等。这些结果显示铵离子影响脂肪酸和丝氨酸的生物合成，并调节安丝菌素 P 3生物合成基因的转录水平。至于异丁醇，实验表明异丁醇促进安丝菌素 P 3生物合成前体CoA的供应，并影响氧化还原相关的基因和蛋白的表达水平。这些信息不但为安丝菌素 P 3发酵操作及其生物合成途径的改造提供了有益信息，还可为其它大环内酯类抗生素的发酵提供借鉴[4]。

参考文献

[1]王石雷,何俊.安丝菌素P-3衍生物及其在制备治疗胃癌药物中的应用:CN202110829626.3[P].CN202110829626.3.

[2]朱晓媛.微生物发酵法制备安丝菌素P-3的研究[D].中南林业科技大学,2014.DOI:10.7666/d.Y2630573.

[3]贾永亮.镁离子添加提高抗癌药物安丝菌素P-3产量的研究[D].华东理工大学,2011.

[4]林锦霞.橙色珍贵束丝放线菌发酵生产抗癌药物安丝菌素P-3的研究[J].华东理工大学, 2011.